郝肖瓊， 李延康， 付旭陽， 賈方毅

(1包頭醫(yī)學院生理學教研室， 2內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014040)

在排卵前卵泡中，卵泡壁層顆粒細胞表達的C型利尿鈉肽(C-type natriuretic peptide, NPPC)與表達在卵丘顆粒細胞中的利尿鈉肽受體2(natriuretic peptide receptor 2, NPR2)結(jié)合，產(chǎn)生的環(huán)鳥苷酸(cyclic guanosine monophosphate, cGMP)通過縫隙連接進入卵母細胞，維持了卵母細胞減數(shù)分裂的阻滯[1]。在每個生殖周期中，由下丘腦垂體前葉釋放的促黃體素(luteinizing hormone, LH)激活卵泡壁層顆粒細胞中的促黃體素受體(luteinizing hormone receptor, LHR)，導致卵母細胞減數(shù)分裂的恢復。激活LHR能夠降低NPPC mRNA的表達，同時降低了NPPC蛋白的含量[2]，而我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，在NPPC存在的情況下，LH可通過降低NPR2活性誘導卵母細胞減數(shù)分裂的恢復[3]，這表明在減數(shù)分裂恢復過程中，NPR2的失活起著至關(guān)重要的作用。LH本質(zhì)上通過促進顆粒細胞中表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)的表達轉(zhuǎn)激活卵丘細胞中的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)發(fā)揮作用[4]。我們近期的研究表明，LH-EGFR信號動員內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫升高了卵丘細胞內(nèi)的鈣離子水平，導致NPR2與NPPC的親和性降低，使NPR2失活，卵母細胞恢復減數(shù)分裂[3]；早期也有研究表明，在穩(wěn)定表達NPR2的293T細胞系中，鈣離子能夠降低NPR2的磷酸化水平，使NPR2失活[5]。這些結(jié)果說明鈣離子在降低NPR2活性的過程中發(fā)揮著重要作用，然而，LH-EGFR信號究竟怎樣升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平誘導卵母細胞減數(shù)分裂恢復，目前還不清楚。

細胞內(nèi)鈣庫儲存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜系統(tǒng)中，胞內(nèi)鈣庫的釋放是由多種通路調(diào)控的，磷脂酰肌醇信號通路是十分重要的一種，許多胞外刺激物可激活磷脂酰肌醇信號通路，導致1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor, IP3R)介導鈣庫釋放鈣離子[6]。IP3R是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子釋放通道[7]，廣泛表達于基本所有類型的細胞中[8]。由IP3R調(diào)節(jié)的鈣離子釋放過程對許多胞內(nèi)活動十分重要,如基因轉(zhuǎn)錄、細胞增殖、受精、發(fā)育、細胞凋亡細胞間通訊和激素分泌等[9]。

在本研究中，我們證明了LH-EGFR信號通路通過IP3R升高卵丘細胞內(nèi)的鈣離子水平，從而使NPR2失活，cGMP下降，導致卵母細胞減數(shù)分裂恢復。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

21～23日齡(12～14 g)雌性C57BL/6J小鼠共150只，全部用于注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)，之后取卵巢內(nèi)卵丘-卵母細胞復合物(cumulus-oocyte complexes, COCs)用于實驗。小鼠購于中科院遺傳所實驗動物中心，許可證號為SCXK (京) 2015-0019，于SPF級實驗動物房飼養(yǎng)，22～24 ℃恒溫，12 h/12 h交替光照/黑暗，自由采食飲水。

2 實驗試劑與儀器

PMSG(浙江寧波激素廠);NPPC、EGF、2-氨乙基二苯基硼酸酯(2-aminoethyl diphenyl borate, 2-APB)、肝素(heparin)和LH(Sigma)；Fluo 3-AM(日本同仁化學研究所)；MEMα粉末狀培養(yǎng)基(Gibco)；胎牛血清(FBS;Thermo)；RNA提取試劑盒RNeasy Micro Kit和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒QuantiTect (Qiagen)；TransStart Green qPCR SuperMix(全式金公司)；cGMP檢測試劑盒(Cayman)。

體式鏡 (Lecia)；A1激光共聚焦顯微鏡(Nikon)；real-time PCR儀(Appiled Biosystems)；細胞培養(yǎng)膜(Millipore)。

3 實驗方法

3.1COCs的分離及培養(yǎng) 小鼠腹腔注射PMSG,每只5 U，44～48 h后頸椎脫臼處死，分離卵巢，刺破卵泡，挑選形態(tài)良好，卵丘細胞包裹均勻的COCs。實驗分組如下：對照(control)組(僅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF組、NPPC+10 μg/L EGF+不同劑量2-APB組、NPPC+10 μg/L EGF+不同劑量Heparin組、10 μmol/L 2-APB組以及200 mg/L heparin組，將COCs置于按實驗分組不同預先添加了不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；培養(yǎng)4 h后，將卵丘細胞去掉，觀察并統(tǒng)計卵母細胞生發(fā)泡破裂(germinal vesicle breakdown, GVBD)的百分率(GVBD%)，卵母細胞內(nèi)無明顯生發(fā)泡(germinal vesicle, GV)即認為發(fā)生GVBD，GVBD%代表卵母細胞減數(shù)分裂恢復情況。每次實驗每組使用30枚COCs。

3.2卵泡的分離及培養(yǎng) 卵巢取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，用1 mL注射器分離卵泡，選擇直徑約為300～400 μm、反應良好的卵泡，將分離好的卵泡置于孔徑0.44 μm的細胞培養(yǎng)膜上。實驗分為4組：control組、1 mg/L LH組、 LH+10 μmol/L 2-APB組以及LH+200 mg/L heparin組。培養(yǎng)膜懸浮放置在按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；4 h后，刺破卵泡，將卵丘細胞去掉以觀察卵母細胞減數(shù)分裂恢復情況。每次實驗每組使用15枚卵泡。

3.3卵丘擴展 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分為4組：control組(僅添加30 nmol/L NPPC)、NPPC+10 μg/L EGF組、NPPC+10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB以及NPPC+10 μg/L EGF+200 μmol/L heparin組。MEMα培養(yǎng)液按處理組不同預先添加不同試劑待用，各組培養(yǎng)液額外添加5% FBS幫助細胞貼壁；吸取按不同實驗處理組準備好的添加了不同試劑的培養(yǎng)液制作微滴，每個微滴體積10 μL，微滴置于玻底培養(yǎng)皿中以便后續(xù)拍照記錄，將COCs置于不同處理組的微滴中，覆蓋石蠟油，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；12～16 h后結(jié)束培養(yǎng)，觀察卵丘擴展情況。每次實驗每組使用15枚COCs。

3.4RNA的提取 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分組同3.3，COCs置于按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中培養(yǎng)，6 h后，收集COCs，總RNA提取依照RNeasy Micro Kit操作指南進行，總RNA的反轉(zhuǎn)錄依照QuantiTect反轉(zhuǎn)錄體系進行，得到cDNA。

3.5real-time PCR 采用25 μL體系：TransStart Green qPCR SuperMix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，Dye 0.5 μL，ddH2O 8 μL，cDNA 2 μL。在ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)下進行反應，每個樣品重復3次，所有實驗重復3次。實驗所用引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，序列見表1。

表1 Real-time PCR 引物序列

F: forward; R: reverse.

3.6細胞內(nèi)鈣離子水平檢測 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分組同3.3，COCs置于按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中培養(yǎng)2 h，PBS清洗，加入5 μmol/L鈣離子熒光探針Fluo 3-AM，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育20 min，之后PBS清洗，在A1激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內(nèi)鈣離子水平，綠色熒光表示胞內(nèi)鈣離子水平，熒光強度代表胞內(nèi)鈣離子水平相對值。每次實驗每組使用15枚COCs。

3.7cGMP水平檢測 COCs取自注射PMSG 44～48 h的小鼠卵巢，實驗分組同3.3，COCs置于按實驗分組不同預先添加不同試劑的MEMα培養(yǎng)液中培養(yǎng)(每組需100枚COCs)，2 h后結(jié)束培養(yǎng)，PBS清洗，收集各組COCs，cGMP含量依據(jù)cGMP酶聯(lián)免疫試劑盒(Cayman)中提供的方法進行檢測。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，統(tǒng)計推斷采用方差分析(ANOVA)和SNK-q檢驗，用SigmaPlot 13.0軟件進行統(tǒng)計分析并作圖，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學顯著性。

結(jié) 果

1 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導的卵母細胞減數(shù)分裂恢復

IP3R是一種調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫鈣離子釋放的重要通道。我們研究了EGF是否通過IP3R升高胞內(nèi)鈣離子水平。結(jié)果表明，EGF促進了卵母細胞減數(shù)分裂的恢復，GVBD%為(91.42±0.72)%，而IP3R的抑制劑2-APB和heparin能有效抑制EGF誘導的卵母細胞減數(shù)分裂恢復(P<0.05)，GVBD%分別為(52.58±1.45)%和(47±1.22)%,見圖1A；且2-APB與Heparin的抑制作用是劑量依賴性的,見圖1B、C。這些結(jié)果表明，IP3R在EGF誘導的卵母細胞減數(shù)分裂恢復中發(fā)揮重要作用。

2 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導的卵丘擴展

EGF在誘導卵母細胞減數(shù)分裂恢復的過程中伴隨著卵丘擴展，卵丘擴展對于卵子的正常受精至關(guān)重要。因此，我們檢測了2-APB及heparin在EGF誘導的卵丘擴展中的作用。結(jié)果表明，與對照組相比，EGF促進了卵丘細胞的擴展與卵丘擴展因子的表達，而2-APB及heparin均能顯著抑制EGF誘導的卵丘擴展現(xiàn)象，且卵丘擴展因子Has2、Ptgs2、Ptx3與Tnfaip6的表達量較EGF組均顯著降低(P<0.05)，見圖2。這一結(jié)果表明IP3R也參與了EGF誘導的卵丘擴展。EGF誘導減數(shù)分裂恢復與卵丘擴展往往并行，且有研究表明，鈣離子在卵丘擴展過程中也發(fā)揮重要作用[10]。本結(jié)果進一步說明了IP3R在減數(shù)分裂恢復過程中的重要意義。

Figure 1.The effect of 2-APB and heparin on EGF-induced meiotic resumption. A: COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin; B: the dose-dependent effects of 2-APB on oocyte meiotic resumption; C: the dose-dependent effects of he-parin on oocyte meiotic resumption. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group;△P<0.05vs2-APB group;▲P<0.05vsheparin group.

圖1 2-APB及heparin對EGF誘導卵母細胞減數(shù)分裂恢復的影響

3 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制EGF誘導的卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平升高

激活I(lǐng)P3R鈣離子通道導致細胞內(nèi)鈣離子水平升高，接下來我們研究了2-APB和heparin對EGF誘導的胞內(nèi)鈣離子水平升高的影響，鈣離子探針Fluo 3-AM作為胞內(nèi)鈣離子水平變化的指示劑。研究結(jié)果表明，對照組鈣離子熒光(綠色熒光)強度微弱，添加EGF后，卵丘細胞內(nèi)鈣離子熒光強度明顯增加，這與之前的研究[11]結(jié)果相同，接著，我們添加了2-APB和heparin，發(fā)現(xiàn)這2種抑制劑均能明顯抑制EGF誘導的胞內(nèi)鈣離子水平升高，且鈣離子熒光強度也顯著降低(P<0.05),見圖3。這些結(jié)果表明，EGF可能通過激活I(lǐng)P3R鈣離子通道導致卵丘胞內(nèi)鈣離子水平升高，誘導卵母細胞減數(shù)分裂恢復，若阻斷IP3R的作用，則EGF不能誘導胞內(nèi)鈣離子水平的升高，那么卵母細胞也無法恢復減數(shù)分裂。

4 IP3R抑制劑2-APB和heparin對COCs中cGMP水平的影響

NPPC處理后COCs中cGMP水平是否升高能夠代表NPR2鳥苷酸環(huán)化酶的活性，卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平升高誘導卵母細胞減數(shù)分裂恢復，本質(zhì)上是高水平的鈣離子導致了NPR2的失活，使cGMP水平下降。因此，我們研究了2-APB和heparin在EGF誘導減數(shù)分裂恢復過程中對COCs內(nèi)cGMP水平的影響。同之前的研究[1]結(jié)果一致，NPPC處理2 h后，COCs中cGMP含量明顯上升，添加EGF降低了胞內(nèi)cGMP水平(P<0.05)，然而，EGF的降低作用能夠被2-APB和heparin顯著逆轉(zhuǎn)(P<0.05),見圖4。這一結(jié)果表明，EGF通過IP3R升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，最終誘導卵母細胞減數(shù)分裂的恢復。

Figure 2.The effect of 2-APB and heparin on EGF-enabled cumulus expansion.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. A: morphological changes of cumulus expansion with different treatments after 12～16 h of culture; B: real-time PCR results forHas2,Ptgs2,Ptx3andTnfaip6in cumulus cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖2 2-APB及heparin對EGF誘導的卵丘擴展的影響

Figure 3.The effect of 2-APB and heparin on EGF-mediated calcium elevation.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin.Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖3 2-APB及Heparin對EGF誘導卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平升高的影響

Figure 4.The effect of 2-APB and heparin on cGMP level in COCs.COCs were cultured in MEMα medium containing 30 nmol/L NPPC alone, or supplemented with 10 μg/L EGF, 10 μg/L EGF+10 μmol/L 2-APB or 10 μg/L EGF+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖4 2-APB及heparin對COCs內(nèi)cGMP水平的影響

5 IP3R抑制劑2-APB和heparin抑制LH誘導的卵母細胞減數(shù)分裂恢復

前面的研究中，我們在COCs體外培養(yǎng)模型下，證明EGF通過IP3R升高胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，導致cGMP水平的下降，卵母細胞減數(shù)分裂恢復。為了進一步模擬生理環(huán)境，我們使用卵泡培養(yǎng)模型，探究IP3R在LH誘導的卵母細胞減數(shù)分裂恢復過程中是否發(fā)揮作用。研究結(jié)果表明，LH促進減數(shù)分裂的恢復，GVBD%為(91.00±1.15)%，而2-APB和heparin顯著抑制了LH誘導的減數(shù)分裂恢復(P<0.05)，GVBD%分別(51.33±1.45)%和(46.75±0.94)%，見圖5。LH本質(zhì)上通過激活EGFR發(fā)揮作用，因此，本結(jié)果證明LH-EGFR信號確實通過IP3R升高胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，減數(shù)分裂恢復。

討 論

排卵前卵泡中的卵母細胞一直阻滯在減數(shù)分裂I前期的雙線期，NPPC與其受體NPR2結(jié)合，產(chǎn)生的cGMP是維持減數(shù)分裂阻滯的關(guān)鍵因子[1]，LH通過促進顆粒細胞中EGF樣生長因子的表達[12]，轉(zhuǎn)激活卵丘細胞中的EGFR，誘導卵母細胞恢復減數(shù)分裂[4]。前期的研究表明，激活EGFR升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平，導致NPR2與NPPC的親和性下降，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母細胞恢復減數(shù)分裂。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LH-EGFR信號通過IP3R升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平，誘導卵母細胞減數(shù)分裂的恢復。

Figure 5.The effect of 2-APB and heparin on LH-induced meio-tic resumption. Follicles were cultured with MEMα medium alone, or supplemented with 1 mg/L LH, 1 mg/L LH+10 μmol/L 2-APB or 1 mg/L LH+200 mg/L heparin. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEGF group.

圖5 2-APB及heparin對LH誘導的減數(shù)分裂恢復的影響

細胞內(nèi)鈣信號作為調(diào)節(jié)細胞活動的重要信使，參與了多種細胞生理反應。胞內(nèi)高水平鈣離子一方面來源于質(zhì)膜鈣泵的開放，使胞外鈣離子內(nèi)流，另一方面來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的釋放。我們前期的研究已經(jīng)證明，激活EGFR升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平，使NPR2失活，cGMP水平下降，卵母細胞恢復減數(shù)分裂，而EGF誘導的卵丘細胞內(nèi)高水平鈣離子來源于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫的釋放[3]。IP3R和蘭尼堿受體(ryano-dine receptor, RyR)均為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道，我們發(fā)現(xiàn)RyR的抑制劑tetracaine并不能抑制EGF誘導的卵母細胞減數(shù)分裂恢復(結(jié)果未顯示)，然而，IP3R的抑制劑2-APB和heparin卻能劑量依賴性的抑制EGF誘導的減數(shù)分裂恢復，此外，2-APB和heparin有效抑制了EGF升高的卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平，鈣離子水平的升高是EGF促進減數(shù)分裂恢復的關(guān)鍵原因。這些結(jié)果表明IP3R在EGF誘導的卵母細胞減數(shù)分裂恢復中發(fā)揮作用，EGF激活I(lǐng)P3R鈣離子通道，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放鈣離子，導致了卵丘細胞內(nèi)具有高水平鈣離子。然而，2-APB和heparin并不能完全逆轉(zhuǎn)EGF誘導的減數(shù)分裂恢復，提示可能還有其它互補途徑，這需要進一步的研究。

我們發(fā)現(xiàn)2-APB和heparin同樣能夠抑制EGF誘導的卵丘細胞擴展，卵丘擴展與卵母細胞減數(shù)分裂恢復的時空調(diào)控對于正常的排卵進程至關(guān)重要，而激活I(lǐng)P3R鈣離子通道升高了胞內(nèi)鈣離子水平，說明鈣離子可能也參與了EGF誘導的卵丘擴展，這與之前的報道一致[10]，同時，這些結(jié)果也表明了鈣離子對減數(shù)分裂的作用不僅是單一的促成熟，還能夠促進卵丘擴展，鈣離子的這些作用能夠確保卵子正常的成熟與排卵。

EGF通過IP3R升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平，而鈣離子的重要意義在于使NPR2失活，導致cGMP水平下降，最終破壞卵母細胞減數(shù)分裂的阻滯狀態(tài)[13-14]。2-APB和heparin不但抑制了EGF誘導的卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平升高，還能夠有效逆轉(zhuǎn)EGF介導的胞內(nèi)cGMP水平降低，這說明IP3R介導的卵丘細胞內(nèi)高水平鈣離子導致了NPR2的失活，使cGMP水平下降，最終促進卵母細胞減數(shù)分裂的恢復。之前的結(jié)果表明鈣離子可使NPR2失活[15]，我們的結(jié)果也與之一致。

由于卵丘細胞不表達LH受體，因此，LH主要通過激活卵丘細胞中的EGFR發(fā)揮作用，2-APB和he-parin同樣抑制了LH誘導的減數(shù)分裂恢復，之前的研究表明LH處理升高了卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平導致NPR2失活[3]，結(jié)合此結(jié)果，說明LH-EGFR信號通過IP3R升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平，高水平鈣離子使NPR2失活，cGMP水平下降，最終誘導卵母細胞減數(shù)分裂的恢復。

本研究結(jié)果進一步闡明了卵母細胞減數(shù)分裂恢復的分子機理，為臨床輔助生殖中建立更為完善的卵母細胞體外成熟體系、提高卵母細胞體外成熟質(zhì)量提供了科學依據(jù)。

致謝：感謝中國農(nóng)業(yè)大學生物學院張美佳教授在論文寫作過程中給予的指導。