王雅麗， 杜若琛， 高淵濤， 李 宵， 李承罡， 原一桐， 王 菲， 田 峰， 李鵬飛， 王春芳△

(1山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 山西 太原 030001； 2南昌大學(xué)， 江西 南昌 330000; 3山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科， 山西 太原 030013)

抑郁癥是一種廣泛存在的慢性疾病，可以影響思想、情緒和身體健康。目前發(fā)展中國(guó)家的門(mén)診病人中抑郁癥和抑郁癥狀的發(fā)生率明顯上升，并已高于發(fā)達(dá)國(guó)家，尤其是在一些特殊群體中發(fā)病率明顯升高[1]。作為一種創(chuàng)傷引起的長(zhǎng)期性損傷疾病，脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)可導(dǎo)致患者癱瘓、截癱、四肢癱瘓和其它終生殘疾[2-3]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，22%的SCI患者臨床表現(xiàn)出明顯的抑郁癥狀[4]，是全球抑郁癥患病率的4.5倍以上[1， 5]；超過(guò)40%的SCI患者中出現(xiàn)食欲不振、快感缺乏等抑郁情緒[6-8]。因此，心理社會(huì)問(wèn)題在SCI研究中變得更加突出。目前普遍的認(rèn)識(shí)是SCI嚴(yán)重影響患者運(yùn)動(dòng)能力和功能獨(dú)立性，同時(shí)對(duì)患者以及其家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[9]，患者產(chǎn)生心理上的不利因素導(dǎo)致抑郁癥狀的出現(xiàn)。

在抑郁癥中，常可以發(fā)現(xiàn)患者有神經(jīng)可塑性受損[10]，根據(jù)抑郁癥的神經(jīng)可塑性假說(shuō)有望開(kāi)發(fā)新的、更有效的治療手段[11]。神經(jīng)可塑性主要表現(xiàn)在突觸可塑性，與認(rèn)知、記憶和應(yīng)激緊密相關(guān)，一直是現(xiàn)在抑郁癥研究的主要目標(biāo)[12]。海馬作為大腦邊緣系統(tǒng)的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)，是一個(gè)情感、動(dòng)機(jī)產(chǎn)生和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵部位。研究表明，抑郁癥的發(fā)病與患者大腦海馬神經(jīng)元的丟失及突觸發(fā)生的減少密切相關(guān)，海馬的結(jié)構(gòu)功能以及突觸可塑性極易發(fā)生異常變化[13-14]。據(jù)此我們推測(cè)SCI患者罹患抑郁癥高風(fēng)險(xiǎn)的原因與海馬突觸可塑性有關(guān)，即除卻心理層面因素外，海馬生理結(jié)構(gòu)的改變加劇了抑郁癥的發(fā)生。因此，探討海馬突觸可塑性在抑郁癥中的作用，將進(jìn)一步明確SCI所致抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，并提供有效的治療策略。

然而，關(guān)于這一主題的研究很少，缺少一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。我們從動(dòng)物模型出發(fā)進(jìn)行研究，有助于增進(jìn)對(duì)脊髓損傷和神經(jīng)精神疾病之間復(fù)雜相互作用的認(rèn)識(shí)，支持對(duì)SCI后抑郁的臨床理解。因此，本研究通過(guò)建立小鼠SCI模型，探討SCI引發(fā)的高抑郁癥風(fēng)險(xiǎn)是否與海馬生理結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，為闡述SCI后抑郁的發(fā)病機(jī)制及臨床干預(yù)提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

8周齡FVB雌性小鼠40只，SPF級(jí)，體質(zhì)量25～30 g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK(晉)2015-0001。所有小鼠保持在具有12 h光照/黑暗循環(huán)的溫控室(20～25 ℃)，相對(duì)濕度為50%～60%的環(huán)境中飼養(yǎng)。

2 主要試劑

HE染色試劑盒購(gòu)自索萊寶公司；PrimeScript RT和TB Green? Premix Ex Taq試劑盒均購(gòu)自TaKaRa。

3 主要方法

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照(control)組(20只)和模型(model)組(20只)，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，適應(yīng)1周，自由飲食。

3.2SCI動(dòng)物模型的制作 根據(jù)文獻(xiàn)[15]的方法應(yīng)用Impactor M-Ⅲ spinal cord contusion system擊打脊髓制作損傷模型。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，完全麻醉后固定于手術(shù)臺(tái),皮膚常規(guī)消毒，暴露第10胸椎(T10)，應(yīng)用Impactor M-Ⅲ spinal cord contusion system擊打脊髓制作損傷模型。術(shù)后用紅外燈照射，3 d內(nèi)肌注青霉素G(4 000 U)，預(yù)防感染。每天早晚各給小鼠排尿1次，直到其恢復(fù)自主排尿。

3.3Basso Mouse Scale (BMS)評(píng)分 分別在術(shù)后1、3、5、7、10，14和21 d進(jìn)行BMS評(píng)分[16]。由3名研究人員單獨(dú)盲評(píng)(n=10)。

3.4糖水偏好實(shí)驗(yàn) 在術(shù)前1 d對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)訓(xùn)練，每只小鼠單獨(dú)1籠，前12 h給與兩瓶1%蔗糖水，后12 h給與兩瓶純水。在術(shù)后1、3、5、7、10、14和21 d對(duì)每只模型組小鼠及對(duì)照組進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)，提供充足食物，禁水6～8 h，然后同時(shí)給與已稱重的純水及1%蔗糖水，24 h后測(cè)各瓶的飲水量，計(jì)算出糖水偏好百分比結(jié)果用以判斷動(dòng)物快感缺乏情況。糖水偏好百分比(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

3.5懸尾實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組和模型組小鼠分別在術(shù)后5、7、10、14和21 d進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)。先將小鼠轉(zhuǎn)移至安靜的實(shí)驗(yàn)房間適應(yīng)1 h。將小鼠尾部后1/3處固定于懸尾試驗(yàn)架上，頭向下，頭部離箱底15 cm，在安靜避光環(huán)境下，觀察5 min，前2 min統(tǒng)計(jì)小鼠不動(dòng)前的潛伏期時(shí)間，后3 min記錄小鼠不動(dòng)的總時(shí)間。結(jié)果用以評(píng)價(jià)小鼠絕望狀態(tài)。

3.6HE染色 小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，完全麻醉后暴露心臟，先用0.9%生理鹽水灌注，然后4%多聚甲醛灌注小鼠。待灌注成功后，解剖小鼠大腦部位，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定24 h，制作石蠟切片，然后進(jìn)行HE染色，最后中性樹(shù)脂封片后鏡下觀察并拍片記錄。通過(guò)HE染色觀察海馬內(nèi)部細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化。

3.7電鏡 模型組和對(duì)照組每組隨機(jī)選取3只小鼠，1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，完全麻醉后，暴露心臟，灌注4%多聚甲醛和生理鹽水，灌注結(jié)束后快速斷頭取腦，參照邊緣系統(tǒng)解剖圖譜切取海馬CA3區(qū)1 mm×1 mm×1 mm組織塊，置于3%戊二醛中固定2 h，然后磷酸緩沖液漂洗3次。l%鋨酸固定液固定2 h，磷酸緩沖液漂洗。常規(guī)丙酮脫水、透明，包埋，制備厚度約70 nm超薄切片，采用醋酸雙氧鈾對(duì)切片進(jìn)行染色30 min，雙蒸水漂洗3次，然后用檸檬酸鉛染色10 min，漂洗3次，待切片干燥后，采用JEM-1011型透射電鏡下進(jìn)行觀察。采用多點(diǎn)平均法測(cè)量突觸間隙寬度，參照文獻(xiàn)[17]報(bào)道的方法，測(cè)量突觸后膜致密物(postsynaptic density, PSD)厚度和突觸活性區(qū)長(zhǎng)度，參考Jones等[18]的方法計(jì)算突觸界面曲率(突觸界面弧長(zhǎng)與弦長(zhǎng)之比)。通過(guò)電鏡觀察海馬亞細(xì)胞突觸的結(jié)構(gòu)變化。

3.8RT-qPCR 取模型組和對(duì)照組小鼠各3只，解剖海馬組織。依照說(shuō)明書(shū)TRIzol(TaKaRa)提取總RNA，使用酶標(biāo)儀測(cè)定RNA的濃度及吸光度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后使用TB Green? Premix Ex Taq進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 s預(yù)變性;95 ℃ 3 s和60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。最后采用2-ΔΔCt法對(duì)脊髓損傷小鼠海馬區(qū)突觸后致密蛋白95(postsynaptic density protein 95，PSD-95)和突觸小泡蛋白(synaptophysin，SYP)在mRNA水平的表達(dá)變化進(jìn)行測(cè)定。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

BMS評(píng)分被用于評(píng)估術(shù)后小鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。術(shù)后1、3、5、7、10、14和21 d的BMS評(píng)分結(jié)果顯示，術(shù)后模型組在1 d和3 d時(shí)運(yùn)動(dòng)功能完全喪失，7 d時(shí)運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)恢復(fù)跡象，第21 d時(shí)趨于平穩(wěn)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The BMS score of each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 各組在不同時(shí)點(diǎn)的BMS評(píng)分

以糖水偏好實(shí)驗(yàn)和懸尾實(shí)驗(yàn)反映小鼠的抑郁情況。糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組1～21 d無(wú)顯著差異，與對(duì)照組相比，模型組除第1天外術(shù)后7 d小鼠糖水消耗百分比差異最大(P<0.01)，即術(shù)后7 d小鼠糖水消耗量最低，然后第10天開(kāi)始上升，第21天趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The sucrose preference in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol groups.

圖2 各組的糖水偏好度百分比

懸尾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，對(duì)照組1～21 d無(wú)顯著差異，與對(duì)照組相比，模型組術(shù)后7 d和10 d小鼠不動(dòng)時(shí)間顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，隨后開(kāi)始不動(dòng)時(shí)間減少，在第21天趨于穩(wěn)定，見(jiàn)圖3。

通過(guò)綜合以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們確定了脊髓損傷后第7天小鼠的抑郁程度最顯著，因此選用7 d這個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)的研究。

Figure 3.The immobility time of tail suspension test in each group. Mean±SD.n=10.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 各組的懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間

2 HE染色法檢測(cè)海馬的形態(tài)變化

為了檢測(cè)SCI引起抑郁時(shí)的海馬部位病理學(xué)的改變，我們?cè)谛g(shù)后7 d取模型組和對(duì)照組的海馬組織，進(jìn)行HE染色。在高倍鏡(×400)及低倍鏡(×200)下觀察結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠海馬細(xì)胞形態(tài)飽滿完整，排列有序，結(jié)構(gòu)清楚;與對(duì)照組相比，模型組CA3區(qū)細(xì)胞排列稍紊亂，數(shù)量稍減少，形態(tài)欠規(guī)則,見(jiàn)圖4。

3 透射電鏡檢測(cè)突觸的結(jié)構(gòu)變化

為了進(jìn)一步觀察海馬的結(jié)構(gòu)變化，我們選取了術(shù)后7 d模型組和對(duì)照組小鼠海馬CA3區(qū)組織進(jìn)行電鏡分析，觀察海馬突觸超微結(jié)構(gòu)的變化。和對(duì)照組相比，模型組突觸數(shù)量減少，突觸前膜內(nèi)突觸小泡減少，突觸后致密物密度降低,見(jiàn)圖5。

Figure 4.HE staining of hippocampal tissues in each group.

圖4 各組海馬組織的HE染色

對(duì)突觸的結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行分析，與對(duì)照組相比，模型組突觸活動(dòng)區(qū)長(zhǎng)度變短，突觸后致密物厚度變薄，突觸間隙寬度增加，突觸界面曲率減小(P<0.05)，見(jiàn)表2。

4 RT-qPCR檢測(cè)小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)

為了進(jìn)一步檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)是否變化，我們通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)了術(shù)后7 d模型組和對(duì)照組小鼠海馬組織PSD-95和SYP mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，模型組PSD-95和SYP的mRNA表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

SCI的主要后果是長(zhǎng)期殘疾，嚴(yán)重影響運(yùn)動(dòng)能力和功能獨(dú)立性，以及患者心理健康及生活質(zhì)量，對(duì)社會(huì)及家庭造成了巨大的負(fù)擔(dān)。然而臨床上往往只關(guān)注了其身體的狀況，卻忽視了對(duì)其心理造成的影響。有研究表明了心理功能的降低對(duì)SCI患者生活質(zhì)量具有顯著的負(fù)面影響[19]，所以關(guān)注脊髓損傷病人的心理疾病將是我們所要研究的重點(diǎn)。在本研究中，我們關(guān)注的是脊髓損傷小鼠抑郁模型與其調(diào)控情緒的器官海馬的結(jié)構(gòu)和功能變化之間的關(guān)系。

Figure 5.Ultrastructure of synapses in hippocampal CA3 region of mice in each group under transmission electron microscope. A: control group, the scale bar=500 nm; B: control group, the scale bar=200 nm; C: model group, the scale bar=500 nm; D: model group, the scale bar=200 nm. The white arrows represent synapses.

圖5 透射電鏡下各組小鼠海馬CA3區(qū)突觸的超微結(jié)構(gòu)

表2 各組小鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)

*P<0.05vscontrol group.

Figure 6.The relative mRNA expression levels of PSD-95 and SYP in hippocampal tissues of mice in each group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 各組小鼠海馬組織PSD-95和SYP的mRNA表達(dá)量

我們首先制作小鼠脊髓損傷模型，然后通過(guò)糖水偏好實(shí)驗(yàn)和懸尾試驗(yàn)，與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠表現(xiàn)為快感缺失，不動(dòng)時(shí)間增加，說(shuō)明脊髓損傷小鼠發(fā)生了抑郁樣行為。并且糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示術(shù)后1 d和7 d糖水消耗量最低，術(shù)后第1天小鼠由于疼痛，虛弱而攝入飲水大量減少，所以該天的數(shù)據(jù)受多種因素的影響而去除。懸尾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示術(shù)后第7天和第10天有顯著差異，所以綜合以上結(jié)果最終我們選擇了第7天來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

海馬參與情感、記憶、內(nèi)分泌整合等過(guò)程，與人類情感性疾病的發(fā)生關(guān)系密切[20-21]。有研究報(bào)道，抑郁的發(fā)病與海馬突觸可塑性有關(guān)，以往對(duì)抑郁癥的研究發(fā)現(xiàn)，抑郁患者的海馬結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，突觸數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)破壞[22]，我們推測(cè)其脊髓損傷引起抑郁的生物學(xué)機(jī)制有可能與該假說(shuō)有關(guān)。突觸是實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元間信息傳遞的基本結(jié)構(gòu)，可以傳遞生物信號(hào)，形成神經(jīng)環(huán)路[12]。突觸可塑性是大腦基本的功能之一:感知、評(píng)估和存儲(chǔ)復(fù)雜信息的能力，以及對(duì)隨后相關(guān)刺激做出適當(dāng)?shù)倪m應(yīng)性反應(yīng)的能力[23]。這種關(guān)鍵的大腦功能在短期和長(zhǎng)期記憶中都扮演著重要的角色，而這些變化背后的機(jī)制與病理生理學(xué)和包括抑郁癥在內(nèi)的多種神經(jīng)生物學(xué)疾病的治療有關(guān)。因此，我們進(jìn)一步研究了模型組小鼠的抑郁樣行為的機(jī)制，評(píng)估突觸可塑性在抑郁發(fā)展中的意義。在本研究中，我們的結(jié)果表明脊髓損傷模型小鼠的海馬形態(tài)發(fā)生改變，突觸結(jié)構(gòu)異常，符合了這一特征。

突觸蛋白標(biāo)志物主要有PSD-95和SYP。PSD-95是膜相關(guān)鳥(niǎo)苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinase, MAGUK)家族蛋白的成員之一，是突觸后密度中豐富的支架蛋白,存在于成熟的興奮性谷氨酸能突觸內(nèi)，是一種重要的神經(jīng)細(xì)胞骨架蛋白，是神經(jīng)信息傳遞的重要基礎(chǔ)，且與離子通道功能、突觸活動(dòng)、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)有關(guān)，是突觸后成分的標(biāo)志物，在突觸可塑性中起重要作用，調(diào)控突觸的數(shù)目，促進(jìn)突觸的形成[24-26]。SYP是一種特異性存在于所有神經(jīng)末梢的突觸前囊泡蛋白，與突觸功能密切相關(guān)，是突觸前成分的標(biāo)志物，并且研究表明SYP的功能與突觸可塑性關(guān)系密切[27-30]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證了SYP與PSD-95 mRNA表達(dá)的水平，與對(duì)照組相比，模型組該基因水平顯著降低，意味著海馬神經(jīng)突觸前、后結(jié)構(gòu)均發(fā)生了變化，使突觸可塑性降低，進(jìn)一步說(shuō)明脊髓損傷后的抑郁與突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變有關(guān)。

總的來(lái)說(shuō)，上述結(jié)果表明脊髓損傷促進(jìn)了一種重要的神經(jīng)精神病學(xué)特征，這種特征與突觸可塑性假說(shuō)有關(guān)。我們認(rèn)為突觸結(jié)構(gòu)及功能的變化可能是脊髓損傷后抑郁發(fā)病的潛在機(jī)制之一。所以，臨床上在治療SCI的同時(shí)應(yīng)當(dāng)關(guān)注其抑郁情況，且干預(yù)手段不應(yīng)僅限于抗抑郁類藥物，海馬結(jié)構(gòu)的破壞這一生理變化也可能是SCI后抑郁癥高發(fā)病率的原因之一。