張旼旼 黃新宇 戴 慧

杭州市腫瘤醫(yī)院 浙江 杭州 310002

晚期肝癌患者常伴有體力、免疫功能、營(yíng)養(yǎng)狀況低下等狀況[1]，往往不能耐受放療、化療等積極治療措施。尋求能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑制肝癌細(xì)胞增殖，且患者更易耐受的治療方法成為治療所需。益氣活血軟堅(jiān)解毒方（YHRJ）是由生黃芪、炒白術(shù)、藤梨根、白花蛇舌草、田三七、半枝蓮、水紅花子等中藥組成的復(fù)方制劑，前期研究中已發(fā)現(xiàn)，該方劑在肝癌的治療中有增效減毒的作用。本文中，我們將探討YHRJ在抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖作用中的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與瘤株：動(dòng)物：BALB/c小鼠，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)條件：恒溫22±2℃，濕度50%～60%，光照每12小時(shí)明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20次/小時(shí)。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號(hào)SYXK（浙）2013-0184。瘤株：H-22肝癌細(xì)胞瘤株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 藥物與試劑：藥物：益氣活血軟堅(jiān)解毒方（YHRJ）組成：生黃芪、藤梨根、白花蛇舌草、半枝蓮各30g，炒白術(shù)15g，田三七、水紅花子各8g，凌霄花9g，炮山甲10g。常規(guī)水提取，配成等效劑量YHRJ 3.4g/ml、高劑量YHRJ 6.8g/ml，4℃保存?zhèn)溆?。奧沙利鉑(OXA)：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品，用5%葡萄糖液調(diào)配成1g/L的溶液，遮光保存。試劑：蘇木素染液為servicebio產(chǎn)品，伊紅染液購(gòu)于珠海貝索生物技術(shù)有限公司，增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）抗體為Affinity產(chǎn)品，免疫組化試劑盒產(chǎn)自MDL，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒均為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物模型制備：取48只小鼠，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H-22肝癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，于頸部右側(cè)皮下接種0.2ml，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，待腫瘤增殖至可以觸及時(shí)，將動(dòng)物隨機(jī)分為6組：A組：對(duì)照（NS）組；B組：OXA組（1.5mg/kg）；C組：等效劑量YHRJ組（3.4g/ml生藥，0.3ml）；D組：等效劑量YHRJ+OXA組（B+C聯(lián)合給藥）；E組：高劑量YHRJ組（6.8g/ml生藥，0.3ml）；F組：高劑量YHRJ+OXA組（B+E聯(lián)合給藥）。對(duì)照組及YHRJ單藥組采用灌胃的給藥方法，每天分別給于0.9%NaCl及YHRJ（等效劑量濃度為3.4g/ml生藥，高劑量濃度為6.8g/ml生藥）各0.3ml，1次／d，連續(xù)14d；OXA組采用腹腔注射OXA（劑量為1.5mg/kg，用5%葡萄糖液調(diào)配成0.5ml/鼠，1次/d）連續(xù)14d；聯(lián)合組每天灌胃給予YHRJ 0.3ml及腹腔注射OXA 0.5ml，1次/d，連續(xù)14d。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法：分述如下。

1.4.1 YHRJ對(duì)H-22肝癌細(xì)胞小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響：每隔3天觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑(L)和橫徑(W)，單位為毫米(mm)。2周后處死小鼠，腫瘤體積=(L×W2)/2；腫瘤抑瘤率=[(A-B)/A]×100%。A為模型組對(duì)照組的腫瘤體積，B為給藥實(shí)驗(yàn)組的腫瘤體積。

1.4.2 HE染色觀察肝癌組織細(xì)胞的形態(tài)變化：取腫瘤組織放入10%中性甲醛固定，取材包埋切片。經(jīng)常規(guī)脫蠟、脫水，蘇木素染色，鹽酸乙醇分化，伊紅液染色后脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。400倍顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.3 免疫組化檢測(cè)肝癌組織中細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）的蛋白的表達(dá)：將肝組織石蠟切片脫蠟、脫水，進(jìn)行抗原熱修復(fù)，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，按照免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行免疫雜交后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。切片在200倍顯微鏡下隨機(jī)選取不重復(fù)6個(gè)視野（其中棕色部分即為蛋白表達(dá)區(qū)域，藍(lán)色為細(xì)胞核。圖片采用Image pro plus軟件分析，計(jì)算棕色蛋白表達(dá)面積和累計(jì)光密度）。

1.4.4 RT-PCR檢測(cè)小鼠腫瘤組織中PCNA、轉(zhuǎn)錄因子NF-KB、細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的mRNA的表達(dá)：將腫瘤組織用Trizol法提取總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃，15min；85℃，5min。按照PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃，10min變性；95℃，15s；60℃，60s；40次循環(huán)。RT-PCR所用引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，作圖采用Graph-Pad Prism 8軟件。兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 YHRJ對(duì)H-22肝癌細(xì)胞小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響：與NS組相比，各給藥組腫瘤體積均有所縮小，其中，除等效劑量YHRJ組外，其他各組中腫瘤體積均縮小顯著（P＜0.05或P＜0.01）；兩聯(lián)合組抑瘤率均達(dá)35%以上，且均大于OXA組，其中，高劑量YHRJ+OXA組較OXA組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），表明YHRJ可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，濃度越高，抑瘤效果越顯著。詳見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腫瘤終體積及抑瘤率（±s）

表2 各組小鼠腫瘤終體積及抑瘤率（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

images/BZ_26_1310_656_2302_727.png—30.03 7.09 38.25 24.29 50.26 A組B組C組D組E組F組8 8 8 8 8 8 465.4±118.1 325.7±65.3*432.4±102.4▲287.4±93.7**352.4±94.3*231.5± 68.2**▲▲

2.2 HE染色觀察肝癌組織細(xì)胞的形態(tài)變化：從圖1可知，NS組腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，細(xì)胞密集，細(xì)胞呈現(xiàn)多邊形或不規(guī)則形，細(xì)胞核較大，核仁清晰、核膜完整、核分裂相明顯。給藥后，等效劑量YHRJ組、高效劑量YHRJ組中腫瘤細(xì)胞有一定程度壞死輕微，核深染的腫瘤細(xì)胞數(shù)量以及核分裂象有一定程度減少。等效劑量YHRJ+OXA組、高劑量YHRJ組、高劑量YHRJ+OXA組相較于NS組療效明顯，可見(jiàn)腫瘤組織中出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞壞死現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死程度從高到低依次為：等效劑量YHRJ+OXA組、高劑量YHRJ+OXA組、OXA組、高劑量YHRJ組、等效劑量YHRJ組。

圖1 HE染色觀察YHRJ對(duì)小鼠肝癌增殖的影響（HE染色，400倍）

2.3 免疫組化觀察檢測(cè)PCNA的表達(dá)：各組小鼠腫瘤組織中均有PCNA表達(dá)，與NS組相比，各給藥組中PCNA表達(dá)均有一定程度下降，表明YHRJ可下調(diào)PCNA的表達(dá)，其中高劑量組效果更顯著（P＜0.05）。等效劑量YHRJ+OXA組、高劑量YHRJ+OXA組中PCNA的表達(dá)較OXA組也有顯著性下降（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 YHRJ方對(duì)小鼠肝癌中PCNA表達(dá)的影響（±s）

表3 YHRJ方對(duì)小鼠肝癌中PCNA表達(dá)的影響（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，▲P＜0.05。

images/BZ_27_177_385_1160_443.png4210.7±560.2 2835.0±573.9**3767.9± 681.7▲1859.8±631.8**▲3086.4±1097.6*2067.0±557.1**▲A組B組C組D組E組F組6 6 6 6 6 6 29987.8±3957.0 20351.2±3967.1**26828.7±4832.3▲13360.7±4649.3**▲22247.5±7419.7*14864.5±4015.3**▲

2.4 實(shí)時(shí)定量PCR：與NS組比較，各給藥組腫瘤組織中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平均顯著性下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。與OXA組比較，等效劑量YHRJ聯(lián)合+OXA組、高劑量YHRJ+OXA組腫瘤組織中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平均下調(diào)，但未見(jiàn)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 腫瘤組織中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平（±s）

表4 腫瘤組織中PCNA、NF-KB及Cyclin D1的mRNA水平（±s）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

images/BZ_27_173_1460_1173_1518.pngA組B組C組D組E組F組1.00±0.09 0.72±0.07*0.79±0.07*0.68±0.08**0.75±0.11*0.60±0.07**3 3 3 3 3 3 1.00±0.09 0.68±0.11*0.77±0.11*0.61±0.08**0.74±0.08*0.58±0.10**1.00±0.09 0.7±0.12*0.80±0.08*0.66±0.06**0.72±0.10*0.61±0.08**

3 討論

細(xì)胞周期紊亂是腫瘤最主要的發(fā)生機(jī)制，細(xì)胞周期中各類分子、蛋白的異常表達(dá)都可能引起腫瘤的發(fā)生[2]。本研究通過(guò)測(cè)量小鼠肝癌H-22細(xì)胞移植瘤大小，證實(shí)YHRJ可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)，HE染色結(jié)果也表明，YHRJ可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生壞死，抑制細(xì)胞增殖。為探討其可能作用機(jī)制，作者檢測(cè)了細(xì)胞周期中參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程的相關(guān)蛋白、基因的表達(dá)情況。

增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)是一種分子量為36KD的酸性蛋白，為DNA聚合酶δ的輔助因子，PCNA在G1晚期表達(dá)增加，S期達(dá)到高峰，其量的變化與DNA合成一致，是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。在腫瘤細(xì)胞中，PCNA呈現(xiàn)過(guò)表達(dá)狀態(tài)[3]。本研究通過(guò)免疫組化檢測(cè)組織細(xì)胞中PCNA蛋白、PCR法檢測(cè)細(xì)胞中PCNA mRNA水平發(fā)現(xiàn)，YHRJ可下調(diào)PCNA蛋白和mRNA的表達(dá)，提示YHRJ可能通過(guò)抑制組織細(xì)胞中PCNA蛋白的合成、PCNA mRNA的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。

NF-KB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其在癌癥增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用，且與較差的預(yù)后相關(guān)[4]。細(xì)胞周期蛋白D1也在許多惡性腫瘤的細(xì)胞生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用[5-6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，NF-κB可通過(guò)磷酸化p65和IκB等分子，上調(diào)其下游分子Cyclin D1，促使細(xì)胞發(fā)生分裂與增殖。Cyclin D1蛋白的過(guò)表達(dá)會(huì)使細(xì)胞增殖不斷進(jìn)行，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[7]。本研究中的結(jié)果也論證上述觀點(diǎn)，YHRJ可抑制NF-KB/Cyclin D1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)抑制肝癌H-22細(xì)胞增殖，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

綜上所述，YHRJ能夠顯著抑制肝癌H-22細(xì)胞移植瘤的生長(zhǎng)，對(duì)肝癌H-22的增殖具有抑制作用，其發(fā)揮抑制作用的機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)PCNA的表達(dá)、抑制NFKB/Cyclin D1信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這一結(jié)果，將為YHRJ在肝癌的治療研究中提供更為有力的證據(jù)。