金錦花，李科巖，張 玲，王玉慧，鄧曉明

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院麻醉科，北京 100144）

酪氨酸激酶受體由20 個家族，近60 種膜蛋白組成。人類成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR）是酪氨酸激酶受體家族中的一員，由四個高度保守的跨膜受體（FGFR1-4）和一個無細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（FGFR5）受體組成，主要集中在細(xì)胞表面[1-3]。

FGFR1 在幼年期或傷口愈合期擴張皮膚中的成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[4-5]，F(xiàn)GFR1 的不適當(dāng)表達(dá)、點突變、錯誤的選擇性剪切以及基因組改變都可導(dǎo)致FGF/FGFR1 信號傳導(dǎo)的調(diào)控紊亂[6-8]。為深入研究FGFR1 在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)發(fā)生過程中的作用機制，筆者構(gòu)建了FGFR1 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-FGFR1，為后繼研究FGFR1 的醫(yī)學(xué)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑真核表達(dá)載體p-CDNA3.1（-），E Coli.DH5a 菌株，HEK293T 細(xì)胞為本實驗室保存。LipofectamineTM 3000 購于美國Invotrigen 公司。逆轉(zhuǎn)錄酶，Pyrobest 高保真DNA 聚合酶，限制性核酸內(nèi)切酶BamH I and Hind III，T4 連接酶均購于日本Takara 公司。鼠抗人HA 單克隆抗體，HRP-山羊抗鼠二抗購自Cell Signaling Technology 公司。Goat anti-mouse Cy3 二抗購自Thermo 公司。其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 引物設(shè)計及合成參照GenBank 的FGFR1基因序列（NM_023110.2），采用Primer 5.0 軟件設(shè)計引物:（1）克隆FGFR1 基因的引物：上游引物序列為5'-ATATGGATCCGCCGCCACCATGTGGAGCTGGAAGTGC-3'，下游引物序列為5'-AAGCTTTCACGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGCGGCGTTTGAGTCCGCCA-3'，為了便于和載體pCDNA3.1 連接，在此對引物的兩端分別加入了BamH I and Hind III 酶切位點。為了便于后續(xù)對表達(dá)蛋白的檢測，在下游引物中加入了HA 標(biāo)簽的序列；（2）pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒的鑒定引物：上游引物序列為5'-ATGTGGAGCTGGAAGTGC-3'，下游引物序列為5'-TCAGCGGCGTTTGAGTCCGC-3'，所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 FGFR1 基因的克隆采用RNA 抽提試劑盒（Qiagen 公司）提取人胎盤組織中的總RNA，并以總RNA 為模板，用Takara 公司的逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。PCR 擴增FGFR1 基因，擴增片段長度為2 469 bp。

1.2.2 pcDNA3.1-FGFR1 表達(dá)載體的構(gòu)建及載體鑒定限制性核酸內(nèi)切酶BamH I and Hind III 對PCR 產(chǎn)物及質(zhì)粒pcDNA3.1 進行雙酶切后，在T4 DNA 連接酶作用下16 ℃連接過夜。氯化鈣轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化的菌液涂布于含氨芐青霉素（Amp）的平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h，挑取陽性克隆，進行BamH I 和Hind III 雙酶切鑒定和PCR 鑒定，陽性質(zhì)粒的菌液送北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前1 d 將HEK293T 細(xì)胞按3×105/mL 分別接種于6 孔板內(nèi)。待細(xì)胞貼壁后將2.5 μg質(zhì)粒 DNA，5 μL lipofectamineTM3000，用500 μL opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋并混勻，室溫靜置15 min；將DNA／lipofectamine 3000 混合物加入6 孔板，培養(yǎng)箱中孵育5 h 后換液。

1.2.4 免疫印跡檢測FGFR1 基因在HEK293T 細(xì)胞中的表達(dá)pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞48 h，裂解細(xì)胞，12%的SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后用濕轉(zhuǎn)移法，電轉(zhuǎn)印到0.22 μm 孔徑的PVDF 膜上，在5%BSA 室溫封閉2 h。加入鼠抗人HA 一抗（1:3 000），兔抗人β-actin 一抗（1:3 000），4℃孵育過夜。一抗充分漂洗后，二抗室溫孵育1 h，加入HRP 顯色底物，X 光片曝光顯影。

1.2.5 免疫熒光檢測FGFR1 基因在HEK293T 細(xì)胞中的表達(dá)細(xì)胞接種在蓋玻片上培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到70%匯合度時，pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，4%多聚甲醛室溫固定15 min，滴加鼠抗人HA 抗體液，4℃孵育過夜。一抗漂洗后再分別用CY3 一抗鼠IgG 孵育45 min，PBS 洗后，DAPI 復(fù)染核，抗淬滅封片劑封片。

2 結(jié)果

2.1 提取完整的人胎盤組織總RNA

從圖1 中可以清晰地看到28 S，18 SrRNA 兩條主帶清晰，表明所提的總RNA 完整性較好，無明顯降解，可用于后續(xù)RT-PCR 反應(yīng)。

圖1 人胎盤組織總RNA 電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA extracted from human placenta tissue

2.2 克隆FGFR1 基因

PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，得到了一條特異性條帶（圖2），與預(yù)期擴增的片段大?。? 469 bp）一致，而且無非特異性條帶的干擾，擴增的特異性較強。

圖2 FGFR1 基因的克隆Fig.2 Cloning of FGFR1 gene

2.3 正確構(gòu)建pcDNA3.1-FGFR1 真核表達(dá)質(zhì)粒

電泳結(jié)果（圖3）顯示，兩條片段大小分別為5.5 Kbp 和2 469 bp，表明目的片段已成功的克隆在pcDNA3.1 載體上。將陽性重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果證明本文擴增的FGFR1 cDNA 序列與基因庫的序列完全一致。

圖3 雙酶切法鑒定pcDNA3.1-FGFR1 質(zhì)粒Fig.3 Identification of the pcDNA3.1-FGFR1 by restrictive enzyme digestion assay with BamH I and HindIII

2.4 免疫印跡分析FGFR1 基因在HEK293T 細(xì)胞中的高效表達(dá)

結(jié)果見圖4，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-FGFR1 的HEK 293T 細(xì)胞裂解產(chǎn)物有一條明顯的特異性條帶，大小約130 KD，而對照組（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1 載體的HEK293T 細(xì)胞）結(jié)果為陰性。表明轉(zhuǎn)染pCDNA3.1載體的HEK293T 細(xì)胞中高水平地表達(dá)了外源性的FGFR1 因子。實驗重復(fù)3 次以上，結(jié)果均一致。

圖4 免疫印跡分析FGFR1 在HEK293T 細(xì)胞的表達(dá)Fig.4 Immunoblot analysis of FGFR1expression in HEK293T cells

2.5 免疫熒光分析FGFR1 基因在HEK293T 細(xì)胞中的高效表達(dá)

免疫熒光染色分析（圖5）表明，在對照組細(xì)胞（轉(zhuǎn)染pCDNA3.1 載體的HEK293T 細(xì)胞）的細(xì)胞膜中沒有FGFR1 的表達(dá)（圖5A）。而在細(xì)胞膜中有較強的紅色熒光信號（圖5B）

3 討論

成纖維細(xì)胞生長因子（FGFs）是一組同源的肝素結(jié)合多肽，其家族包含23 個成員[9]，它們具有很高的序列同源性及類似的生物學(xué)功能[10]。FGFs具有廣泛的生物學(xué)功能，可以調(diào)控胚胎發(fā)育中細(xì)胞的增殖、遷移、分化；參與機體內(nèi)血管生成、組織修復(fù)；維護正常機體組織內(nèi)的結(jié)構(gòu)和功能。成纖維細(xì)胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFR）是一類具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受體，其家族成員都是酪氨酸激酶受體[11]，F(xiàn)GFR 失調(diào)與多種癌癥有關(guān)，如尿路上皮癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌和肺腺癌[12-15]，由于其重要的功能，F(xiàn)GFR 被認(rèn)為是治療各種癌癥的藥物靶標(biāo)[16-17]。在多種成纖維細(xì)胞生長因子受體中，F(xiàn)GFR1 在傷口愈合、生長發(fā)育、骨骼形成、細(xì)胞的增殖、分化、血管生成等進程中起著十分重要的作用[18-22]，以FGFR1 為研究方向的皮膚創(chuàng)傷愈合治療，展現(xiàn)了可期的應(yīng)用前景[23]，如果筆者能夠獲得FGFR1真核表達(dá)載體，就有可能將其應(yīng)用于后續(xù)皮膚創(chuàng)傷的治療研究。

圖5 免疫熒光分析FGFR1 在293T 細(xì)胞的表達(dá)Fig.5 Immunofluorescence analysis of FGFR1 expression in 293T cells

本實驗成功構(gòu)建了小鼠FGFR1 重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-FGFR1，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)讓其在HEK293T 細(xì)胞表達(dá)，為進一步研究FGFR1在胚胎發(fā)育期及創(chuàng)傷修復(fù)過程中的皮膚修復(fù)奠定實驗基礎(chǔ)。本研究的創(chuàng)新點在于通過免疫熒光手段分析FGFR1 在293T 細(xì)胞表達(dá)以后在細(xì)胞的定位情況，通過基因工程手段給FGFR1 加上HA 標(biāo)簽，方便后期的western blot 檢測和免疫熒光檢測，以及將來研究免疫共沉淀技術(shù)檢測FGFR1 和其他分子的相互作用。