從左到右依次為Michael Meagher 博士、Mani Krishnan 和Claire Davies 博士

多年來，開發(fā)單克隆抗體 （ mAb ） 藥物的路徑已經(jīng)得到了明確的定義和完善。但基因療法面臨的情況就不一樣了。雖然基因療法早在幾十年前就開始出現(xiàn)了，但直到最近幾年才有了進(jìn)展，但是，這一領(lǐng)域依舊有很多未知和挑戰(zhàn)。由于缺乏合規(guī)的流程、一致的分析和明確的監(jiān)管指南，基因療法開發(fā)者必須創(chuàng)建自己的商業(yè)化路徑。這篇文章中三位業(yè)內(nèi)科學(xué)家，就基因療法的挑戰(zhàn)以及如何克服這些挑戰(zhàn)進(jìn)行了探討。

Michael M. Meagher 博士是圣猶德兒童研究醫(yī)院的副總裁，負(fù)責(zé)藥物生產(chǎn)和質(zhì)量;Mani Krishnan 是 SCIEX CE & 生物制藥業(yè)務(wù)部門的副總裁兼總經(jīng)理;Claire Davies 博士是賽諾菲生物分析副總裁。

挑戰(zhàn)一：基因療法不是傳統(tǒng)的生物學(xué)

蛋白質(zhì)藥物是使用成熟的細(xì)胞系制造的。Meagher 博士說，一批蛋白質(zhì)或單抗是相當(dāng)均勻的，可以通過分析整個(gè)批次以確認(rèn)其特性和質(zhì)量。但用于基因療法和轉(zhuǎn)基因細(xì)胞療法的病毒載體卻不是這樣。兩到四個(gè)質(zhì)粒必須轉(zhuǎn)染每個(gè)細(xì)胞，并產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)適合封裝轉(zhuǎn)基因并能產(chǎn)生病毒載體的衣殼蛋白。沒有穩(wěn)定的細(xì)胞系可以產(chǎn)生同樣的病毒載體。每一個(gè)細(xì)胞都必須被一系列質(zhì)粒復(fù)合物轉(zhuǎn)染才能產(chǎn)生病毒載體?？梢韵胂笫〉母怕屎驼T導(dǎo)異質(zhì)性的程度有多高。

Davies 博士認(rèn)為，改善基因療法生產(chǎn)的關(guān)鍵是開發(fā)一致的、可擴(kuò)展的平臺(tái)，以提高生產(chǎn)產(chǎn)量?！暗彤a(chǎn)量問題可以通過改善轉(zhuǎn)染技術(shù)和載體設(shè)計(jì)來解決，以提高細(xì)胞系和病毒包裝的穩(wěn)定性。與此同時(shí)，更高細(xì)胞密度工藝的發(fā)展、改進(jìn)的下游純化工藝以及更好的關(guān)鍵原料控制將提高生產(chǎn)的質(zhì)量和產(chǎn)量?！?/p>

目前實(shí)現(xiàn)穩(wěn)健工業(yè)生產(chǎn)的另一個(gè)障礙是缺乏快速的分析方法。Krishnan 博士認(rèn)為：“ 如果沒有快速的檢測(cè)，完全了解所有相關(guān)工藝參數(shù)，及其對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量屬性影響的能力就很有限。這阻礙了穩(wěn)健工藝的發(fā)展。當(dāng)病毒載體被用來修飾細(xì)胞時(shí)，困難就增加了?！?/p>

這就是CAR-T細(xì)胞療法面臨的情況。無論基因運(yùn)載工具是腺病毒（AAV）或慢病毒（ LV ），還是攜帶信使 RNA、引導(dǎo) RNA 或蛋白質(zhì)組成的基因編輯元件，其過程和產(chǎn)生的產(chǎn)物都是高度復(fù)雜的，只能在一定程度上表征。因?yàn)樗鼈兪侨绱藦?fù)雜，觀察經(jīng)過基因改造的細(xì)胞隨時(shí)間的變化是非常必要的。轉(zhuǎn)基因造血干細(xì)胞 （ HSCs ） 的情況更加復(fù)雜，因?yàn)檫@些細(xì)胞是“永久的細(xì)胞”，會(huì)留在患者體內(nèi)。

“如果我們治療的是一個(gè)兩個(gè)月大的嬰兒，在這個(gè)孩子活到 70 歲之前，我們不會(huì)真正知道治療效果如何?！盡eagher 博士說，“研發(fā)工作必須解決這一問題，我們不僅需要評(píng)估患者的長(zhǎng)期存活率，還需要評(píng)估這些療法的長(zhǎng)期影響。”

挑戰(zhàn)二：對(duì)速度的需求

基因療法的前景是巨大的。有超過 7000 種遺傳疾病可以用基因療法治愈。然而，盡管期望、興趣和投資都很高，但制造和分析基因治療產(chǎn)品的技術(shù)仍在進(jìn)化中。許多用于制造基因治療產(chǎn)品的過程借用了基于貼壁細(xì)胞的傳統(tǒng)抗體生產(chǎn)過程，導(dǎo)致滴度非常低。同樣，許多用于基因治療的分析方法也都是傳統(tǒng)的病毒分析方法。Krishnan 說：“雖然這些檢測(cè)方法經(jīng)過了試驗(yàn)和測(cè)試，但獲得結(jié)果需要大量時(shí)間?！崩?，目前的效能、功效和其他特性的檢測(cè)都是以細(xì)胞為基礎(chǔ)的，可能需要長(zhǎng)達(dá)三周的時(shí)間。

“同樣，下游純化后的感染研究 （ TCID50 ） 對(duì)于確認(rèn)衣殼蛋白結(jié)構(gòu)也很重要，但它們可能需要長(zhǎng)達(dá)一周的時(shí)間。為了開發(fā)一個(gè)堅(jiān)實(shí)的制藥生產(chǎn)工藝，實(shí)時(shí)檢測(cè)很重要。為了開發(fā)真正優(yōu)化的流程，并對(duì)是否推進(jìn)一批生產(chǎn)做出有效決策，需要快速得到結(jié)果?！?p>

缺乏優(yōu)化的流程和及時(shí)的檢測(cè)是造成基因療法成本高的巨大因素。使問題更加復(fù)雜的是，目前許多分析方法所得的結(jié)果是可變的。有些方法的正 / 負(fù)差異為 50%。擁有堅(jiān)實(shí)的、接近實(shí)時(shí)的、易于使用的、可重復(fù)的檢測(cè)方法對(duì)基因療法的進(jìn)一步發(fā)展至關(guān)重要。Krishnan 博士繼續(xù)說道。“在合理的時(shí)間內(nèi)提供強(qiáng)有力的快速檢測(cè)反饋，將使能對(duì)患者產(chǎn)生長(zhǎng)期可持續(xù)影響的基因療法的發(fā)展成為可能，并完全改變游戲規(guī)則?！?/p>

Meagher 博士表示，AAV 和慢病毒載體用于基因療法、CAR-T 細(xì)胞和 HSC （ CD34+ ） 治療，基于細(xì)胞的效價(jià)測(cè)定面臨挑戰(zhàn)。他解釋道：“就預(yù)測(cè)效價(jià)模型的可用性而言，確定藥效的技術(shù)目前是有限的，我們也非常希望有生物物理表征方法來指示功能，因?yàn)樗鼈冊(cè)诩铀匍_發(fā)流程方面是非常寶貴的，特別是對(duì)于慢病毒載體。”

其他重要的分析包括衣殼翻譯后修飾的特性，生產(chǎn)過程中使用質(zhì)粒衍生的非產(chǎn)物 DNA 的定量，以及空與滿的衣殼比的測(cè)定?！凹皶r(shí)進(jìn)行有效的分析對(duì)開發(fā)時(shí)間線有巨大的影響”，Meagher 博士指出。

Davies 博士表示，自動(dòng)化和數(shù)據(jù)分析的進(jìn)步有可能減少分析耗時(shí)。完全集成的系統(tǒng)可以在多孔板中制備樣品，自動(dòng)將樣品放入儀器中進(jìn)行分析，然后無縫地將采集到的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到分析軟件中，這將簡(jiǎn)化分析，同時(shí)提高一致性和準(zhǔn)確性。最后，她希望能夠?qū)⒍鄠€(gè)設(shè)備完全集成到一個(gè)自動(dòng)化的工作流程中，并能夠根據(jù)儀器傳感器的反饋有條件地調(diào)整儀器設(shè)置。她補(bǔ)充道：“如果我們能夠?qū)⑿碌姆蛛x系統(tǒng)與多閥配置結(jié)合起來，在分離的模式之間進(jìn)行切換，并在數(shù)據(jù)導(dǎo)出為通用數(shù)據(jù)格式后，將其與自動(dòng)數(shù)據(jù)處理和趨勢(shì)結(jié)合起來，將有助于開發(fā)完全自動(dòng)化的工作流程。”

挑戰(zhàn)三：樣本量困境

病毒載體生產(chǎn)過程中的滴度低導(dǎo)致了對(duì)檢測(cè)所需樣品量的挑戰(zhàn)。在一項(xiàng)研究中，賽諾菲發(fā)現(xiàn)，用于早期臨床試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)批次單抗生產(chǎn)了 2003 瓶，其中 664 瓶被用于測(cè)試，剩下的 1339 瓶用于臨床研究?；蛑委煹纳a(chǎn)批量要小得多，然而，如果是全身性的治療，那么需要檢測(cè)的數(shù)量將會(huì)更高。在 Davies 博士引用的一個(gè)例子中，制造的 220 瓶中，185 瓶被用于測(cè)試，只剩下 35 瓶用于臨床研究。她指出，“即使是罕見疾病，也很難確保有足夠的材料用于臨床試驗(yàn)?！?/p>

低產(chǎn)量和蛋白濃度僅在 0.01 mg/mL 數(shù)量級(jí)是一個(gè)復(fù)雜的挑戰(zhàn)，因?yàn)檫€存在分析方法不成熟和對(duì)產(chǎn)品了解有限的因素。“低產(chǎn)量就需要有戰(zhàn)略性的方法來減少檢測(cè)量”，Davies 博士說，“由于蛋白質(zhì)濃度低和一般的安全要求，基因療法的分析需要更加靈敏?！迸e個(gè)例子，根據(jù) FDA 的指導(dǎo)，考慮到患者使用的平均劑量和滴度，在篩選復(fù)制能力變異的慢病毒載體時(shí)，目前需要大量（每批 10-100 升）來顯示在每個(gè)患者劑量?jī)?nèi)有 < 1 個(gè)具有復(fù)制能力的慢病毒（RCL）。類似的問題也存在于具有復(fù)制能力的 AAV 中，因此顯然需要顯著提高用于此的基于細(xì)胞的分析的靈敏度。

她還指出，也有機(jī)會(huì)開發(fā)精益和戰(zhàn)略性的測(cè)試 / 控制范式，使用平臺(tái)技術(shù)和產(chǎn)品知識(shí)來減少檢測(cè)量需求的穩(wěn)定性測(cè)試設(shè)計(jì)。新型無損檢測(cè)方法的發(fā)展作為藥典方法的替代品，也將減少對(duì)檢測(cè)量的要求。然而，她補(bǔ)充說，任何減少樣本量的解決方案都必須便于質(zhì)量控制。

“我們?cè)谫愔Z菲正在開發(fā)一種多屬性方法，使我們能夠從一個(gè)分析中獲得多個(gè)重要的結(jié)果，從而減少測(cè)試所需的產(chǎn)本總量?！盌avies 博士解釋道。比如用于多種衣殼特異性和 DNA 特異性屬性的方法。賽諾菲和圣猶大兒童研究醫(yī)院都開發(fā)了基于毛細(xì)管電泳（CE）的高靈敏度和高分辨率方法來測(cè)定 AAV 衣殼蛋白純度，該方法顯著減少需要的樣本量，且對(duì)質(zhì)控友好。

挑戰(zhàn)四：不斷發(fā)展的監(jiān)管指導(dǎo)和持續(xù)的溝通

雖然目前對(duì)于使用重組蛋白生物制劑的基因療法還沒有建立規(guī)范指南，但是監(jiān)管當(dāng)局已經(jīng)表示支持正在發(fā)展的基因治療。FDA 持續(xù)制定指導(dǎo)文件，以支持開發(fā)和商業(yè)化這些創(chuàng)新的、改變生活的藥物。最近，F(xiàn)DA 公布了關(guān)于試驗(yàn)藥物中內(nèi)毒素的指南。Meagher 博士認(rèn)為，無論基因治療產(chǎn)品是基于病毒載體，還是結(jié)合了 CRISPR-Cas9 等基因編輯技術(shù)，防止脫靶效應(yīng)都是重點(diǎn)?！癋DA 鼓勵(lì)能快速有效地識(shí)別和量化脫靶的技術(shù)。”

他還補(bǔ)充說，這個(gè)領(lǐng)域正在以異乎尋常的速度發(fā)展：“競(jìng)爭(zhēng)如此激烈，這太棒了，最好的技術(shù)將會(huì)勝出，這只會(huì)使病人受益，F(xiàn)DA 正在與基因療法研發(fā)人員一起學(xué)習(xí)，并努力創(chuàng)造機(jī)會(huì)讓研發(fā)人員可以與 FDA 專家討論，來尋求最佳方法獲得最安全產(chǎn)品。他們希望幫助企業(yè)找到前進(jìn)的最佳途徑?！?h3>展望未來

Krishnan 博士認(rèn)為：“為了充分發(fā)揮基因療法在世界范圍內(nèi)對(duì)患者的潛力，SCIEX 等供應(yīng)商將繼續(xù)與研發(fā)人員合作，不斷創(chuàng)新并推動(dòng)技術(shù)向前發(fā)展，以提供從概念到臨床的基因療法所需的快速、精確、可靠和高效的分析。希望不久以后，這些流程和分析變得足夠合格和完善，并能結(jié)合明確的監(jiān)管指導(dǎo)，確保生物制藥研發(fā)人員有一條良好的道路來開發(fā)和商業(yè)化基因療法，為需要疾病修飾治療或治愈的眾多患者服務(wù)?！?/p>

Meagher 博士從研發(fā)視角提供了一個(gè)觀點(diǎn)：“我們最感興趣的是治療的安全性和加速臨床研究。隨著快速可靠的分析技術(shù)的發(fā)展，市場(chǎng)將得到改善，特別是那些能夠連接基于細(xì)胞的效價(jià) / 療效分析的方法。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來看，基于細(xì)胞的效價(jià)分析將是基因療法釋放檢測(cè)的一部分。當(dāng)我們擁有與細(xì)胞分析相關(guān)的快速分析方法時(shí)，產(chǎn)品開發(fā)的時(shí)間和成本將會(huì)減少，而這一直是我們的目標(biāo)。最偉大的任務(wù)是讓全世界的每個(gè)病人都能負(fù)擔(dān)得起這些療法！”

Davies 博士闡明：“在生產(chǎn)和分析方面，基因和細(xì)胞治療開發(fā)中的創(chuàng)新、戰(zhàn)略性和數(shù)字化方法將促進(jìn)我們對(duì)過程和產(chǎn)品的理解，為患者提供負(fù)擔(dān)得起的個(gè)性化治療。不僅基因療法方法會(huì)不斷改進(jìn)和提速，而且正交工具的開發(fā)將有助于提高我們對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量屬性及其對(duì)患者安全和療效的潛在影響的理解?！保ㄕ悦馈渡羁萍肌罚ň庉?費(fèi)勒萌）