,*

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院·化學(xué)工程學(xué)院,湖北襄陽(yáng) 441000;2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江大慶 163000)

亞側(cè)耳(Hohenbueheliaserotina),又名冬蘑、元蘑、剝?nèi)譡1],屬于真菌門(mén)亞側(cè)耳屬,主要分布在黑龍江和吉林的山區(qū)林區(qū)等地。作為黑龍江山珍特產(chǎn)之一,元蘑味道鮮美,含有蛋白質(zhì)、糖類、多酚及黃酮等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2],深受人們喜愛(ài)。研究發(fā)現(xiàn),亞側(cè)耳多酚能明顯抑制HeLa細(xì)胞的體外增殖[3],而亞側(cè)耳分離得到的27 kDa核糖核酸酶(RNase)也被證明能夠抑制人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)逆轉(zhuǎn)錄酶和減少M(fèi)BL2淋巴瘤細(xì)胞的生成[4]。目前元蘑現(xiàn)代化食品十分豐富,有元蘑膨化食品、元蘑營(yíng)養(yǎng)粥和元蘑運(yùn)動(dòng)飲料等[5-7]。

多糖是多個(gè)單糖以糖苷鍵連接組成的聚合高分子碳水化合物[8],普遍具有免疫調(diào)節(jié)作用[9-11]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),真菌多糖擁有抗癌、抗腫瘤等免疫作用[12-13]。熊川等[14]用水溶性靈芝子實(shí)體多糖刺激RAW264.7細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)細(xì)胞的吞噬能力及細(xì)胞因子分泌量均得到提高。現(xiàn)有關(guān)于亞側(cè)耳多糖的報(bào)道普遍集中在亞側(cè)耳多糖的抗腫瘤、抗氧化、防輻射等方面[15-17],然而其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫活性研究不多見(jiàn)。本文以Raw264.7細(xì)胞為細(xì)胞模型,探討亞側(cè)耳水溶性多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的體外免疫調(diào)節(jié)作用,為亞側(cè)耳多糖產(chǎn)品的合理開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞側(cè)耳 伊春市松源山特產(chǎn)品有限責(zé)任公司;苯酚 福晨化學(xué)試劑廠;氫氧化鈉 永大化學(xué)試劑有限公司;無(wú)水乙醇、硫酸、丙酮 西隴科學(xué)股份有限公司;葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚乙液 索萊寶科技有限公司;RPMI-1640 培養(yǎng)基(含胎牛血清) 美國(guó)Gibco公司;水溶性四唑鹽(WST-1) 瑞士Roche公司;Raw264.7細(xì)胞 美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC)。

FA2004N型分析天平(精確值0.0001 g) 上海精密儀器儀表有限公司;R200-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 瑞士BUCHI公司;EL-800酶聯(lián)檢測(cè)儀 美國(guó)BioTek公司;722S分光光度計(jì) 上海精密儀器科學(xué)有限公司;SF-TDL-5A低俗離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 諾基儀器有限公司;SY-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 亞側(cè)耳多糖的提取及糖含量測(cè)定

1.2.1.1 亞側(cè)耳的預(yù)處理 將選購(gòu)的野生亞側(cè)耳去雜,然后進(jìn)行鼓風(fēng)干燥(75 ℃)12 h,烘干至符合打磨標(biāo)準(zhǔn)后粉碎,過(guò)100目篩后置于干燥器中備用。

1.2.1.2 亞側(cè)耳多糖的提取和純化 根據(jù)前期研究[18-19],結(jié)合所選原料特性后制定提取純化方案。為了去除色素及小分子物質(zhì),先將50 g干燥的亞側(cè)耳子實(shí)體粉末與500 mL濃度為80%的乙醇溶液充分混合,室溫條件下攪拌3 h后,靜置過(guò)夜。將混合液在4000 r/min條件下離心10 min(以下提取純化操作過(guò)程中離心條件相同)后取沉淀,加入蒸餾水混勻(料液比為1∶10 g/mL)。置于水浴鍋中,在100 ℃條件下水浴3 h后再次離心,取上清液。然后將溶液在65 ℃條件下經(jīng)減壓濃縮至原體積的1/5。向濃縮液中緩慢滴加4倍體積的無(wú)水乙醇并充分混合,冰箱中4 ℃靜置一夜。經(jīng)離心棄上清后50 ℃下干燥12 h,得到亞側(cè)耳粗多糖。

將上述粗品用蒸餾水復(fù)溶(亞側(cè)耳粗多糖與水的質(zhì)量比為1∶10),40%乙醇再次沉淀。50 ℃溫度下干燥12 h,得到亞側(cè)耳多糖(HSP)。

1.2.1.3 亞側(cè)耳多糖溶液中多糖含量的測(cè)定 參考改進(jìn)的硫酸-苯酚法測(cè)定亞側(cè)耳多糖中的多糖含量[20]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g于250 mL容量瓶中,加蒸餾水定容到刻度線。分別取標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL至干燥的試管中,每管補(bǔ)充蒸餾水至2.0 mL。分別向試管中添加0.5 mL 5%的苯酚溶液和5 mL的濃硫酸后冷卻至室溫,測(cè)定其在490 nm處的吸光度。

將0.01 g HSP粉末溶于100 mL蒸餾水中。吸取2.0 mL于試管中,加入1.0 mL 5%的苯酚溶液后,迅速加入5 mL濃硫酸,混勻后靜置至室溫。以蒸餾水反應(yīng)物作對(duì)照,在490 nm處測(cè)定吸光度(每組設(shè)置3個(gè)平行,數(shù)值使用平均值)。

1.2.2 亞側(cè)耳多糖對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7的免疫調(diào)節(jié)作用

1.2.2.1 亞側(cè)耳多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞的增殖作用 將巨噬細(xì)胞Raw264.7(100 μL,1×105cell/mL)和濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL的多糖溶液(100 μL)放置于96孔培養(yǎng)板中,空白對(duì)照加等量的生理鹽水。以RPMI-1640(含10%胎牛血清)為培養(yǎng)基的,在37 ℃、5%CO2、95%空氣條件下培養(yǎng)72 h,405 nm下測(cè)吸光度。增殖作用采用WST-1細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒測(cè)定,結(jié)果以免疫細(xì)胞增殖率表示，計(jì)算公式如下:

式(1)

式中:As:實(shí)驗(yàn)組OD值;Ac:空白對(duì)照組OD值。

1.2.2.2 亞側(cè)耳多糖對(duì)巨噬細(xì)胞NO分泌量的影響 將細(xì)胞濃度為1×106cell/mL的巨噬細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)到96孔培養(yǎng)板中,(5% CO2、95%空氣、37 ℃)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后,棄上清。目前在免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中普遍以脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作為陽(yáng)性對(duì)照[21-22]。以PBS(磷酸緩沖鹽溶液)作為空白對(duì)照組、1 μg/mL LPS作為陽(yáng)性對(duì)照組、HSP組的濃度分別為0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL(每孔100 μL)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液(100 μL),與等體積的Griess試劑混合,避光反應(yīng)10 min,再用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)吸收值。NO濃度參考NaNO2(1～200 μmol/L)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y=0.0107x+0.0673,R2=0.9997。

1.2.2.3 亞側(cè)耳多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的影響 對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)進(jìn)行傳代處理,配成細(xì)胞濃度為1×106cell/mL的細(xì)胞懸液置于24孔培養(yǎng)孔中。以1 μg/mL的LPS作為陽(yáng)性對(duì)照,生理鹽水作為空白對(duì)照,腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試驗(yàn)組中添加的多糖濃度梯度為0、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers name and sequence

為了得到良好的線性關(guān)系,白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β因子和前列腺素E2(prostaglandins E2,PGE2)的試驗(yàn)組選擇25 μg/mL濃度以下的濃度進(jìn)行試驗(yàn),各梯度濃度分別為0、3.125、6.250、12.500、25.000 μg/mL。每個(gè)多糖處理組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,以上添加計(jì)量均為100 mL。在37 ℃、5% CO2、95%空氣條件下培養(yǎng)48 h。用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中的細(xì)胞因子的表達(dá)量。

1.2.2.4 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫因子基因表達(dá)的影響(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) HSP(0、12.50、25.00、50.00 μg/mL)或LPS(1 μg/mL)存在下的巨噬細(xì)胞Raw264.7(1×106cell/mL),在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上37 ℃、5%CO2、95%空氣條件下培養(yǎng)18 h。收集細(xì)胞,用Trizol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取總RNA,-80 ℃保存?zhèn)溆?。以提取的RNA(2 μg)為模板,用oligo-(dT)20primer和Superscript III RT(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)制備cDNA,采用Go Taq Flexi DNA 聚合酶(Promega Madison)和PCR引物(表1)用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件:預(yù)變性(94 ℃,3 min),進(jìn)行重復(fù)變性(94 ℃,30 s),退火(56 ℃,40 s)和延伸(72 ℃,1 min)30次,保溫(72 ℃,10 min)。染色后的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上電泳,用凝膠圖像分析軟件進(jìn)行掃描和分析(Kodak Digital Science,Kennesaw,GA,USA)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 亞側(cè)耳多糖中的糖含量

以葡萄糖濃度(x)為橫坐標(biāo),吸光度(y)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。經(jīng)公式計(jì)算得到HSP溶液的糖含量為(85.176±1.47) μg/mL,HSP粉末糖含量為85.18%。由于試驗(yàn)制備得到的HSP并不是由單一的葡萄糖組成,而是一種多糖復(fù)合物,因此需對(duì)亞側(cè)耳多糖進(jìn)行成分分析后,再進(jìn)一步測(cè)定糖含量。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

2.2 亞側(cè)耳多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用

巨噬細(xì)胞作為參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的免疫效應(yīng)細(xì)胞,其功能正常與否直接或間接關(guān)系到免疫應(yīng)答過(guò)程中的抗原呈遞和抗原清除能力[23]。LPS能夠刺激小鼠巨噬細(xì)胞Raw264.7釋放細(xì)胞因子,因此通常以此作為測(cè)定某種成分對(duì)免疫系統(tǒng)是否具有調(diào)節(jié)活性的陽(yáng)性對(duì)照。不同濃度的HSP對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性的影響如圖2a所示。在添加濃度為12.5 μg/mL HSP培育24 h后,Raw264.7細(xì)胞的增殖率明顯升高。并且在12.5～100 μg/mL范圍內(nèi),巨噬細(xì)胞Raw264.7的增殖率隨HSP劑量的增加而增加(P<0.05),呈劑量依賴關(guān)系,且對(duì)Raw264.7無(wú)細(xì)胞毒害作用。添加HSP(1～100 μg/mL)的培養(yǎng)基顏色清澈,細(xì)胞透亮,長(zhǎng)勢(shì)良好,見(jiàn)圖2b、圖2c。

圖2 HSP對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7增殖率的影響Fig.2 Effect of HSP on cell proliferation of Raw264.7 cells注:a:不同字母表明組間的顯著性差異(P<0.05),圖3～圖7同;b:試驗(yàn)前細(xì)胞形態(tài)圖;c:100.00 μg/mL HSP培育24 h后細(xì)胞形態(tài)圖。

2.3 亞側(cè)耳多糖對(duì)巨噬細(xì)胞NO分泌量的影響

NO分泌水平是巨噬細(xì)胞激活的一個(gè)重要指標(biāo)[24]。巨噬細(xì)胞受刺激產(chǎn)生的NO能夠協(xié)同機(jī)體對(duì)抗外來(lái)抗原,影響抗腫瘤、抗病毒和抑制胞內(nèi)病原體增殖等免疫活性[25]。試驗(yàn)細(xì)胞中NO釋放量的變化如圖3,NO的分泌量與HSP劑量呈現(xiàn)正相關(guān),有劑量依賴關(guān)系。HSP低劑量組(12.5 μg/mL)與空白組(無(wú)HSP添加)相比,NO生成量顯著提高(P<0.05)。HSP在濃度為100 μg/mL時(shí),Raw264.7巨噬細(xì)胞分泌NO的量為29.94 μmol/L,與LPS陽(yáng)性對(duì)照組在Raw264.7中生成NO(30.43 μmol/L)的量相接近,兩組之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)中HSP顯著增加了巨噬細(xì)胞釋放NO的能力,可以認(rèn)定為HSP是巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)活性。

圖3 HSP對(duì)巨噬細(xì)胞Raw264.7中NO的影響Fig.3 Effect of HSP on NO production in macrophage Raw264.7 cells

2.4 亞側(cè)耳多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放的影響

真菌多糖可以通過(guò)活化效應(yīng)巨噬細(xì)胞而釋放細(xì)胞因子,從而調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)及免疫通路[26]。其中,TNF-α是自身免疫性疾病中重要的炎癥介質(zhì),能夠激活T細(xì)胞,并誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集,刺激吞噬行為的產(chǎn)生[27-28]。如圖4所示,與亞側(cè)耳多糖濃度為0的空白組相比較,不同含量的多糖組分均能夠刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子TNF-α的活性。TNF-α的分泌量同HSP濃度呈正相關(guān),但是隨HSP濃度的增加,分泌量遞增速度減慢。HSP以100 μg/mL的濃度處理Raw264.7細(xì)胞后,TNF-α含量為14.344 ng/mL,與LPS組相接近,說(shuō)明HSP對(duì)TNF-α的分泌有促進(jìn)作用。

圖4 HSP對(duì)巨噬細(xì)胞中TNF-α釋放的影響Fig.4 Effect of HSP on TNF-α release in macrophages

IL-1β是一種能夠活化巨噬細(xì)胞,并參與抗體產(chǎn)生的免疫因子。圖5為HSP作用下的巨噬細(xì)胞IL-1β表達(dá)量的變化,添加HSP或LPS后較空白組的IL-1β分泌量都極顯著升高(P<0.05)。在韓真[29]的實(shí)驗(yàn)中,使用200 μg/mL的蜜環(huán)菌葡聚糖溶液刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞后,IL-1β含量達(dá)到空白組的1.5倍。而在本試驗(yàn)中,低劑量添加組(3.125 μg/mL)的IL-1β分泌量與空白組相比較,達(dá)到其4倍之多。在25.000 μg/mL HSP作用濃度下刺激RAW264.7免疫細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β分泌量(31.9524 pg/mL,)與1 μg/mL LPS陽(yáng)性對(duì)照組分泌量(31.8793 pg/mL),無(wú)顯著性差異(P>0.05),表明HSP對(duì)IL-1β的釋放具有正向促進(jìn)作用。

圖5 HSP對(duì)巨噬細(xì)胞中IL-1β釋放的影響Fig.5 Effect of HSP on IL-1β release in macrophages

PGE2是廣泛存在于有機(jī)體內(nèi)的一種前列腺素類物質(zhì)。在維持體內(nèi)環(huán)境及炎癥調(diào)節(jié)方面,PGE2能夠有效與不同受體結(jié)合并發(fā)揮相關(guān)作用[30]。HSP對(duì)PGE-2的影響結(jié)果如圖6所示,在3.125～25.000 μg/mL濃度范圍內(nèi),HSP能夠促進(jìn)PGE-2細(xì)胞因子的分泌,并且存在濃度依賴性關(guān)系。在前期研究[24]中,使用真姬菇多糖提取物刺激巨噬細(xì)胞后,PGE2分泌量受添加真姬菇多糖提取物濃度影響,這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。但真姬菇多糖溶液的添加濃度在100 μg/mL時(shí)PGE2分泌量才與陽(yáng)性對(duì)照組相接近,而25 μg/mL HSP刺激產(chǎn)生的PGE2量(1.8174 ng/mL)接近LPS陽(yáng)性對(duì)照組(1.9227 ng/mL),證明HSP對(duì)PGE2有較強(qiáng)的刺激作用。

圖6 HSP對(duì)巨噬細(xì)胞中PGE2釋放的影響Fig.6 Effect of HSP on PGE2 release in macrophages

巨噬細(xì)胞的吞噬能力可直接或間接的體現(xiàn)其免疫應(yīng)答能力。試驗(yàn)中PEG2、IL-1β和TNF-α三種細(xì)胞因子分泌量的變化表明,HSP能夠通過(guò)促進(jìn)免疫因子的產(chǎn)生,從而提高Raw264.7細(xì)胞的免疫防御能力。

圖7 各免疫因子mRNA的RT-qPCR水平Fig.7 RT-qPCR levels of mRNA of immune factors

2.5 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞免疫因子轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響

4 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)亞側(cè)耳水溶性多糖在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫活性和低細(xì)胞毒性。HSP能夠促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞中NO、PGE2、COX-2、IL-6、iNOS、TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子的釋放。此外HSP也能夠有效提高iNOS、COX-2、IL-1β、TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)量。因此HSP可以作為天然免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用到食品及藥品領(lǐng)域中,具有廣闊的研究和應(yīng)用前景。今后,我們將會(huì)對(duì)HSP多糖的免疫活性機(jī)理及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。