（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都 611130）

奶牛乳房炎是導(dǎo)致奶牛場經(jīng)濟(jì)損失的主要因素之一，全球每年因乳房炎造成的損失高達(dá)幾十億美元，我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)起步較晚，在這方面的損失更是巨大[1,2]。引起奶牛乳房炎的病因是紛繁復(fù)雜的，目前將造成該病的原因主要分為物理性因素、病原性因素和環(huán)境性因素三類，其中病原性因素占主要方面，也是造成該病長期存在和難以治愈的主要影響因素[3]。病原性因素又以細(xì)菌為主，根據(jù)其來源和傳播方式的差異，這些病原體可分為接觸傳染性病原體和環(huán)境性病原體兩大類[4]。肺炎克雷伯氏菌則為典型的環(huán)境性致病菌，可直接、間接地經(jīng)口感染或者經(jīng)乳頭感染，引起奶牛呼吸道或乳房炎疾?。▓D1）[5]。本文將對肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行分離鑒定并對防治措施進(jìn)行闡述，以供牧場能更好地防控由該菌引起的乳房炎。

圖1 克雷伯氏菌在奶牛場的傳播示意圖[5]

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

從四川省資陽市、邛崍市、成都市青白江區(qū)的3個(gè)規(guī)?；翀?，分別采集臨床型乳房炎奶樣各10份，用于肺炎克雷伯氏菌的分離培養(yǎng)。

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、LB肉湯、MH瓊脂培養(yǎng)基，購于青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒，購于天根生化科技（北京）有限公司；DL-2000 Marker，2×Taq PCR Master Mix，購于成都擎科生物技術(shù)有限公司；生化試驗(yàn)發(fā)酵管、藥敏紙片，購于杭州微生物試劑有限公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌鍋（上海H申醫(yī)療核子儀器廠），恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司），恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造廠），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），高速離心機(jī)（Eppendorf公司），PCR擴(kuò)增儀（Bio-RAD），電泳儀（北京六一生物科技有限公司），全自動(dòng)凝膠成像儀（Bio-RAD），1～1000μL移液槍（Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采集臨床型乳房炎乳樣，做好標(biāo)記放入低溫采樣箱送至實(shí)驗(yàn)室，在超凈工作臺用無菌棉簽接種至已配制好的TSA培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h，挑取疑似菌落做革蘭氏染色鏡檢，并進(jìn)一步純化、擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)菌生化鑒定

對疑似細(xì)菌做葡萄糖、麥芽糖、木糖、山梨醇的生化管發(fā)酵，并做苯丙氨酸脫氨酶、精氨酸水解酶、鳥氨酸脫羧酶、氧化酶試驗(yàn)，依照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[6]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[7]進(jìn)行生化結(jié)果判定。

1.3.3 細(xì)菌16S rDNA鑒定

挑取疑似為克雷伯氏菌的菌落至1 5 m L離心管中，振蕩過夜培養(yǎng)，取1.5 m L在滅菌的離心管中，按照細(xì)菌D N A提取試劑盒提取步驟，提純細(xì)菌D N A，并作1 6 S r D N A擴(kuò)增。引物序列為F：A G A G T T T G A T C C T G G C T C A；R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

反應(yīng)體系(25μL)：上、下游引物各0.5μL，細(xì)菌基因組1μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 補(bǔ)足體系。反應(yīng)條件：95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 45s，34個(gè)循環(huán)；72℃ 7min。預(yù)期擴(kuò)增片段1500bp，將陽性擴(kuò)增樣品送至華大基因有限公司測序，并在NCBI在線BLAST比對測序結(jié)果，下載同源性較高序列采用MEGA 6.0 軟件建立進(jìn)化樹，進(jìn)行同源性分析。

1.3.4 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)

挑取已分離鑒定的克雷伯氏菌于15mL離心管中，在恒溫振蕩儀過夜培養(yǎng)，于次日取出調(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，并按照CLSI推薦的瓊脂擴(kuò)散法（K-B）進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在培養(yǎng)18～24h后，TSA平板上長出直徑為5～6mm、圓而飽滿、白色或乳白色菌落，用接種環(huán)挑取易拉成絲。革蘭氏染色后在油鏡下可觀察到短粗的革蘭氏陰性菌（圖2）。本次共分離到三株疑似克雷伯氏菌，分別命名為KP1、KP2、KP3。

圖2 分離菌的菌落形態(tài)（a）及革蘭氏染色形態(tài)（b）

2.2 分離菌株的生化特點(diǎn)

生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株KP1、KP2、KP3均能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、木糖、山梨醇，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)、精氨酸水解酶試驗(yàn)、M-R試驗(yàn)、VP試驗(yàn)均為陰性，該試驗(yàn)結(jié)果符合克雷伯氏菌特點(diǎn)。

2.3 16S rDNA鑒定及進(jìn)化樹分析

根據(jù)16S rDNA預(yù)期設(shè)計(jì)擴(kuò)增出了1500bp大小目的片段（圖3），在NCBI在線BLAST比對結(jié)果顯示，三株分離菌均與肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）相似度為99.99%。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示（圖4），分離菌株KP1、KP3與CP031810株、CP031562株、CP032185株親緣關(guān)系較近，分離株KP2則相對較遠(yuǎn)。

圖3 16S rDNA結(jié)果

圖4 16S rRNA 基因系統(tǒng)進(jìn)化分析樹

2.4 分離菌株藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株分離菌株均對阿莫西林、頭孢他啶、頭孢曲松耐藥，對鏈霉素、慶大霉素表現(xiàn)敏感，分離菌株KP1和KP3對青霉素表現(xiàn)中度敏感，菌株KP2則表現(xiàn)耐藥，具體結(jié)果見表1。

表1 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 肺炎克雷伯氏菌的防治

3.1 發(fā)病特點(diǎn)

肺炎克雷伯氏菌為條件性致病菌，在糞便、墊料和土壤中均存在，該菌的傳播主要發(fā)生在擠奶間隔，當(dāng)乳頭接觸到被污染的設(shè)備或物品時(shí)，極有可能會(huì)引發(fā)乳房炎[8,9]。該菌在夏季的感染率要顯著高于其他季節(jié)，一般感染后患牛會(huì)突然出現(xiàn)體溫升高、產(chǎn)乳量下降、食欲減低和脫水癥狀，重者則會(huì)出現(xiàn)起臥困難甚至無法站立，牛奶呈現(xiàn)水樣或血奶[10,11]。

3.2 治療

當(dāng)前大多數(shù)牧場在治療奶牛乳房炎時(shí)選用的藥物為β-內(nèi)酰胺類乳房灌注劑，如阿莫西林、頭孢喹肟等，這類廣譜抗生素雖然對治療部分乳房炎有效果，但長期使用已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的耐藥。根據(jù)本研究的藥敏結(jié)果，針對該菌的治療應(yīng)該首選氨基糖苷類藥物，如慶大霉素等，可以取得良好的臨床效果。

3.3 防控

針對該菌的防控，和大多數(shù)條件性致病菌一樣，首先應(yīng)該是保證牛舍飼養(yǎng)環(huán)境的干燥、潔凈，良好的躺臥環(huán)境是預(yù)防疾病的基礎(chǔ)；再者就是要選擇合適的藥浴液，堅(jiān)持前藥浴和后藥浴可以有效地減少和阻止病原微生物的入侵；最后要注意的一個(gè)點(diǎn)就是飼喂?fàn)I養(yǎng)，不僅要滿足奶牛的日常營養(yǎng)需求，而且要使奶牛保持良好的抵抗力[12,13]。

4 小結(jié)

經(jīng)對牧場30份乳樣進(jìn)行培養(yǎng)，成功分離了3株肺炎克雷伯氏菌。從該菌的藥敏結(jié)果來看，3株分離菌株均對阿莫西林、頭孢他啶、頭孢曲松耐藥，對鏈霉素、慶大霉素表現(xiàn)敏感，分離菌株KP1和KP3對青霉素表現(xiàn)中度敏感，菌株KP2則表現(xiàn)耐藥，故針對該菌的治療應(yīng)該首選氨基糖苷類藥物。由肺炎克雷伯氏菌引起的奶牛乳房炎多在夏季發(fā)生，南方地區(qū)奶牛在夏季多出現(xiàn)熱應(yīng)激，再加上氣候潮濕，無疑為該菌的防控增加了難度，牧場應(yīng)該在保證營養(yǎng)狀況良好的情況下，盡可能地減少臥床、圈舍的污染，保證擠奶前、后的藥浴。