,2

(1.廣東省藥品檢驗(yàn)所,廣東廣州 510663;2.廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州 510006)

明膠膠囊可容納各種固體、半固體、液體,廣泛應(yīng)用于食品和藥品中。為了避光或遮蓋內(nèi)容物達(dá)到美觀效果,部分膠囊生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)添加各種合成色素[1]。合成色素大多屬于煤焦油合成的染料,不僅本身沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,且大多數(shù)對(duì)人體有害,主要包括一般毒性、致瀉性和致癌性,表現(xiàn)為對(duì)人體直接危害,在代謝過(guò)程中產(chǎn)生有害物質(zhì)或合成過(guò)程中帶入的砷、鉛等污染物[2-5]。鑒于此,世界各國(guó)對(duì)合成食用色素的使用種類、使用量及使用范圍均有明確規(guī)定,并隨著研究的深入不斷地調(diào)整相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]。我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了允許作為食品添加劑的11種合成色素(檸檬黃、新紅、莧菜紅、靛藍(lán)、喹啉黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、偶氮玉紅、亮藍(lán)和赤蘚紅)的使用范圍和使用量[8];而合成色素作為藥用,雖然在現(xiàn)行的《中國(guó)藥典》(2015版)沒(méi)有相關(guān)規(guī)定[9],但國(guó)家藥典會(huì)2018年公開(kāi)征求意見(jiàn)的《膠囊(空心膠囊)通則》規(guī)定膠囊中允許添加的合成色素共有10種:檸檬黃、莧菜紅、靛藍(lán)、喹啉黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、偶氮玉紅、亮藍(lán)和赤蘚紅[10]。

我國(guó)對(duì)膠囊中合成色素的使用有相應(yīng)規(guī)定,卻沒(méi)有建立與之匹配的檢測(cè)方法。GB 5009.35-2016只能檢測(cè)檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍(lán)、赤蘚紅7種色素[11],SN/T 1743-2006只能檢測(cè)誘惑紅、酸性紅、亮藍(lán)、日落黃4種色素[12],喹啉黃的檢測(cè)僅有地方標(biāo)準(zhǔn)[13]。為此,本文根據(jù)明膠膠囊的特點(diǎn),改進(jìn)前處理方法,優(yōu)化色譜條件,建立一種能同時(shí)測(cè)定明膠膠囊中11種合成色素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

明膠膠囊 共20批，其中來(lái)自于2018年廣東省監(jiān)督抽驗(yàn)(輔料專項(xiàng))4批，編號(hào)為樣品3～6，來(lái)自于2018年國(guó)家保健食品監(jiān)督抽驗(yàn)的抽驗(yàn)樣品16批，編號(hào)分別為樣品1、樣品2、樣品7～20;甲醇、乙腈 色譜純,Honeywell公司;乙酸銨 GR,阿拉丁試劑公司;木瓜蛋白酶 酶活力≥6000 USPu/mg,E. Merck公司;新紅 標(biāo)品(1000 μg/mL),北京海岸鴻蒙標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)公司;胭脂紅 純度98%,源葉生物科技生物有限公司;檸檬黃、靛藍(lán)二磺酸鈉、喹啉黃、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán) 純度分別為90.0%、86.0%、90.2%、87.0%、83.0%、92.3%,Dr. Ehrenstorfer公司;莧菜紅、偶氮玉紅 純度分別為95.3%、90.7%,Manhage公司;赤蘚紅 純度100%,中國(guó)食品藥品檢定研究院。

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜儀,配備二極管陣列檢測(cè)器 美國(guó)安捷倫公司;SARTORIUS電子分析天平 德國(guó)賽多利斯公司;IKA磁力攪拌器 德國(guó)IKA公司;MILLIPORE超純水發(fā)生器 美國(guó)密理博公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:準(zhǔn)確稱取適量固體標(biāo)準(zhǔn)品(按純度折算),檸檬黃、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)配成2500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,莧菜紅、靛藍(lán)二磺酸鈉配成2000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液,喹啉黃、偶氮玉紅、赤蘚紅配成1000 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:吸取配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及購(gòu)買(mǎi)的成品標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水定容成各組分含量為100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使用時(shí)用純水稀釋成各組分濃度為0.5、25、50、75 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾。

1.2.2 樣品處理 棄去膠囊內(nèi)容物,囊殼擦拭干凈。取囊殼1.0～2.0 g于錐形瓶中,加0.01 g木瓜蛋白酶、水15 mL。將錐形瓶置于磁力攪拌器上60 ℃攪拌30 min,冷卻后轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶,用水定容至刻度,過(guò)0.45 μm 微孔過(guò)濾膜,上機(jī)測(cè)定。

1.2.3 色譜條件 保護(hù)柱:Agilent Zorbax Eclipse XDB C18(4.6 mm×12.5 mm,5 μm);色譜柱:CAPCELL PAK C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):檸檬黃、喹啉黃450 nm,新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、偶氮玉紅、赤蘚紅520 nm;靛藍(lán)二磺酸鈉、亮藍(lán)620 nm;流動(dòng)相:見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫表Table 1 Gradient elution procedure

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次,采用Microsoft Office Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用Origin 9.0對(duì)數(shù)據(jù)作圖,樣品重復(fù)測(cè)定兩次。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.35-2016采用聚酰胺吸附法對(duì)樣品進(jìn)行前處理,對(duì)含赤蘚紅的樣品采用液-液分配法[11]。明膠膠囊成分簡(jiǎn)單,不含有干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì),不需要按照GB 5009.35-2016方法對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的除雜提純[14]。但如果直接將膠囊加熱溶解后提取色素,由于明膠具有膠凝性,溶液冷卻后難以過(guò)濾進(jìn)行測(cè)定。已有學(xué)者對(duì)膠囊中色素的提取做過(guò)研究:劉泰然等[15]采用乙醇氨溶液漂洗浸泡囊殼直至色素提取完全,胡立立等[14]采用超聲提取法,兩種方法均耗時(shí)較長(zhǎng);王翀等[1]將明膠膠囊溶解后采用甲醇沉淀法除去明膠,整個(gè)提取過(guò)程步驟較多。本文以木瓜蛋白酶對(duì)明膠膠囊進(jìn)行水解,明膠分解成能溶于水的多肽后,囊殼中色素即溶于水中,溶液冷卻后也不再凝凍,過(guò)濾方便。該方法步驟少,方便快捷,色素?fù)p失少,并可進(jìn)一步擴(kuò)展用于提取明膠膠囊中其他水溶性色素。

本實(shí)驗(yàn)考察了酶添加量對(duì)色素提取的影響。以2.0 g膠囊殼為底物,分別加入0.001、0.005、0.010、0.020、0.040 g木瓜蛋白酶,60 ℃水解30 min。結(jié)果發(fā)現(xiàn):加酶量0.001 g時(shí),酶量過(guò)低,明膠水解程度不足,仍具有膠凝性,溶液冷卻后成果凍狀凝膠;加酶量增大至0.005 g時(shí),溶液冷卻后為粘稠液體;加酶量≥0.01 g時(shí),溶液放置過(guò)夜后仍具有良好的流動(dòng)性,無(wú)法形成凝膠。因此本方法選擇令明膠無(wú)法凝凍的最低加酶量0.01 g。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)C18柱分離后,由二極管陣列檢測(cè)器于210～630 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描得紫外吸收光譜以確定各組分最大吸收波長(zhǎng),分別為檸檬黃428 nm、新紅506 nm、莧菜紅216 nm、靛藍(lán)288 nm、喹啉黃412 nm、胭脂紅216 nm、日落黃236 nm、誘惑紅214 nm、偶氮玉紅518 nm、亮藍(lán)628 nm、赤蘚紅530 nm,同時(shí)莧菜紅、靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅分別在522、612、506、482、508 nm處也存在較強(qiáng)吸收。

該液相色譜方法的主要難點(diǎn)是喹啉黃和其他10種色素的分離。喹啉黃主要成分為喹啉黃一鈉鹽和二鈉鹽,同時(shí)各有兩種同分異構(gòu)體,在色譜圖上存在4個(gè)主要的色譜峰,極易跟其他色素的色譜峰重疊[13,16-17]。如單獨(dú)考慮最大吸收波長(zhǎng),檸檬黃、喹啉黃的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為420 nm。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),檢測(cè)波長(zhǎng)為420 nm時(shí),亮藍(lán)色譜峰位于喹啉黃第3峰和第4峰之間,分離度分別為1.97和1.40,未達(dá)到完全分離。最終將檸檬黃、喹啉黃檢測(cè)波長(zhǎng)確定為450 nm,在此波長(zhǎng)下,檸檬黃和喹啉黃仍有一定強(qiáng)度的吸收,而亮藍(lán)幾乎無(wú)吸收(見(jiàn)圖1),避免了亮藍(lán)對(duì)喹啉黃的干擾。其他色素參考其最大吸收波長(zhǎng),綜合考慮后選擇520 nm為新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、偶氮玉紅、赤蘚紅檢測(cè)波長(zhǎng),選擇620 nm為靛藍(lán)、亮藍(lán)檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 檸檬黃、喹啉黃和亮藍(lán)光譜圖Fig.1 Spectrograms of tartrazine,quinoline yellow and brilliant blue

2.3 流動(dòng)相的選擇

流動(dòng)相的組成影響化合物的峰形和分離效果。實(shí)驗(yàn)表明,僅用甲醇或乙腈和乙酸銨混合為流動(dòng)相難以實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的分離,而這三者混合使用時(shí)效果更佳。參考GB 5009.35-2016及文獻(xiàn)中流動(dòng)相的梯度洗脫程序[11,18],對(duì)流動(dòng)相溶劑種類、濃度等進(jìn)行了調(diào)整,得到最佳梯度洗脫程序(見(jiàn)表1)。

乙酸銨由于水溶性好,所以常被用作緩沖溶液,但其濃度過(guò)高易造成儀器的腐蝕并清洗困難[14]。本文比較了10、15、20、25、30 mmol/L乙酸銨溶液對(duì)色素分離效果的影響。隨著乙酸銨濃度的提高,喹啉黃1和胭脂紅分離度逐漸減小,當(dāng)乙酸銨濃度為20 mmol/L時(shí),喹啉黃1和胭脂紅分離度僅為1.4,不能完全分離;乙酸銨濃度為25 mmol/L時(shí),喹啉黃1和胭脂紅兩峰明顯已部分重疊。而某些峰呈現(xiàn)相反的趨勢(shì),如檸檬黃和新紅、喹啉黃2和日落黃的分離度隨著乙酸銨濃度提高而逐漸增大。最終選擇乙酸銨濃度為15 mmol/L,在此濃度下各組分分離度均大于1.5,能實(shí)現(xiàn)基線分離。

關(guān)于流動(dòng)相的pH,部分文獻(xiàn)表示乙酸銨溶液需要調(diào)節(jié)至酸性來(lái)進(jìn)行分離[19-21],而另一部分文獻(xiàn)則表示無(wú)需調(diào)節(jié)pH就能獲得良好的分離[11-14,22-23]。本文比較了在流動(dòng)相溶液pH5.5、pH6.0、pH6.5、pH6.8及不調(diào)節(jié)溶液pH(pH6.3)時(shí)各組分分離效果,發(fā)現(xiàn)隨著pH的升高出峰時(shí)間變短,最先出峰的檸檬黃提前0.08 min,最末出峰的赤蘚紅提前0.5 min。由于各色譜峰出峰時(shí)間整體前移且變化幅度最高僅2%,pH的變化最終對(duì)各峰分離效果影響不大,故不調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出濃度

取濃度為0、0.5、25、50、75、100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液上機(jī)測(cè)定,以色譜峰面積對(duì)其質(zhì)量濃度(μg/mL)進(jìn)行線性回歸。稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液至低濃度上機(jī)測(cè)定,以信噪比(S/N)3～5確定樣品的檢出限。11種色素的檢出限為0.3～2.5 mg/kg,在0～100 μg/mL線性范圍內(nèi),相關(guān)系數(shù)r大于0.999,表明各化合物均具有良好的線性關(guān)系?；旌蠈?duì)照品的液相色譜圖見(jiàn)圖2,線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出濃度如表2所示。

圖2 100 μg/mL混合對(duì)照品溶液色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 100 μg/mL mixed reference solution注：A～C分別為450、520、620 nm的色譜圖。

表2 11種色素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and limit of detection concentration of 11 kinds of pigments

表3 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果Table 3 Recovery rate and precision determination results

2.5 方法精密度和回收率

取未添加色素的膠囊殼樣品2 g作為本底,精密加入不同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“1.2.2”節(jié)下方法制備供試品溶液進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。選取高中低三個(gè)加標(biāo)水平,低濃度加標(biāo)水平為12.5 mg/kg,中濃度加標(biāo)水平為125 mg/kg,高濃度根據(jù)各色素最大允許使用量,加標(biāo)水平選擇250～1000 mg/kg進(jìn)行回收試驗(yàn),結(jié)果如表3所示。該方法精密度為0.2%～1.7%,回收率為79.1%～119.3%。結(jié)果表明,本方法能夠滿足檢測(cè)要求。

2.6 實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)定結(jié)果

采用上述方法對(duì)收集的20批樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。如參照《膠囊(空心膠囊)通則》(征求意見(jiàn)稿)的要求：著色劑添加總量原則上不超過(guò)空心膠囊總重量的0.5%[10],有4批產(chǎn)品不符合要求,這4個(gè)批次均來(lái)自于2018年國(guó)家保健食品監(jiān)督抽驗(yàn)的抽驗(yàn)樣品，樣品編號(hào)分別為11、16、17、19。

表4 樣品中色素含量(mg/g)Table 4 Contents of synthetic pigments in samples(mg/g)

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)儀器色譜條件的優(yōu)化,以及針對(duì)樣品特點(diǎn)對(duì)前處理方法的改進(jìn),建立了明膠膠囊中11種合成色素的高效液相色譜分析方法。該方法前處理簡(jiǎn)單,檢測(cè)效率高,同時(shí)回收率高、結(jié)果準(zhǔn)確,可作為明膠膠囊中合成色素的常規(guī)檢測(cè)方法。在當(dāng)今食品藥品質(zhì)量安全備受重視的環(huán)境下,該方法彌補(bǔ)了明膠膠囊中合成色素檢測(cè)方法的空白,可以為企業(yè)以及監(jiān)管部門(mén)控制膠囊質(zhì)量提供技術(shù)支持。