吳海波1,2,任桂鳳1,劉松勇1,黃 瑩1,覃秀熒1,江連洲

(1.北部灣大學食品工程學院,廣西欽州 535011;2.欽州市特色果蔬發(fā)酵重點實驗室,廣西欽州 535011;3.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

大豆起源于中國,是重要的糧食作物、油料作物,為世界五大油料作物之一。在我國,大豆油產(chǎn)量和消費量長期以來一直居于食用植物油首位[1]。目前工業(yè)上常用有機溶劑浸提法制取大豆油,盡管出油率高,成本低,但浸提后溶劑易殘留油中,且粕中蛋白變性嚴重[2]。特別是溶劑浸提以及后期脫膠、脫酸、脫色等精煉階段。油脂長時間處于高溫環(huán)境易導致油脂氧化劣變[3]和一些有益物質(zhì)的損失[4],進而影響油的品質(zhì)。

水相酶法提油是近些年興起的一項有希望取代溶劑浸提制油的環(huán)境友好技術(shù),它利用水作為提取介質(zhì)的同時添加具有破壞植物細胞壁或油脂體結(jié)構(gòu)的酶,促進油脂釋放,同時蛋白及一些親水性物質(zhì)溶解到水相中,從而達到油和蛋白同時提取的目的,具有無溶劑殘留,蛋白變性程度輕的優(yōu)點[5]。目前已在大豆[6]、玉米[7]、葵花籽[8]、花生[9]、菜籽[2]等糧油作物中展開廣泛研究,并取得良好效果。但是水酶法提取大豆油工藝直接得到的游離油非常有限,大部分油都存在于提油過程形成的乳狀液中,需經(jīng)適當?shù)钠迫榉绞讲拍芑厥掌渲械挠?。因此破乳是水酶法提油工藝的關(guān)鍵技術(shù),目前破乳效果較好的方法主要有等電點法[10]、加熱破乳[11]、添加無機鹽[12]、酶法破乳[13]等。水酶法提取的油大部分來自于破乳回收,破乳油的品質(zhì)直接影響水酶法提取油的食用品質(zhì),但對于這些破乳方式回收油的品質(zhì)以及脂肪酸組成目前卻鮮有報道。

本實驗在前期獲得較高總油提取率制備條件基礎(chǔ)上[14],針對粗酶提油過程產(chǎn)生的乳狀液分別采用加熱、等電點法、添加CaCl2法、Alcalase酶法破乳,分析各破乳方式回收油的理化性質(zhì)和脂肪酸組成,并對粗酶水相提油工藝同步所得蛋白的氨基酸組成及風味進行鑒定,旨在綜合評估粗酶提取工藝所得大豆油和蛋白品質(zhì),為環(huán)境友好綠色制油技術(shù)的發(fā)展提供科學技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆(墾農(nóng)22號) 黑龍江省農(nóng)科院,貯存于4 ℃冰箱中;Alcalase堿性蛋白酶(1.2×105U/mL) 諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯 標準品,美國Sigma公司;氫氧化鈉、鹽酸、磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈣、一水合硫酸氫鈉、氫氧化鉀 國藥集團;奎寧 上海源葉生物科技有限公司;甲醇 天津市天力化學試劑有限公司;正已烷 廣東火華科技股份有限公司;枯草芽孢桿菌ATCC 20524 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;發(fā)酵培養(yǎng)基:0.57%低溫脫脂豆粕,1.48%葡萄糖,0.05%KH2PO4,0.5%吐溫80,pH9,121 ℃滅菌20 min。

7890-A氣相色譜 美國安捷倫公司;A200氨基酸分析儀 德國安米諾西斯公司;TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;MY型雙螺桿擠壓機 江蘇牧羊集團;FW80型錘片式粉碎機 中國天津泰斯特儀器有限公司;FD-1型冷凍干燥機 北京比朗實驗設(shè)備有限公司;XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 擠壓膨化豆粉的制備 將大豆粉碎過3 mm篩板后,調(diào)節(jié)水分含量至14%,在擠壓膨化機套筒溫度90 ℃,螺桿轉(zhuǎn)速100 r/min,?？卓讖?8 mm條件下擠壓膨化[15],所得膨化物料粉碎并過100目篩,此時膨化豆粉中油含量22.1%,蛋白質(zhì)含量32.8%,貯存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 粗酶液的制備 采用吳海波等[14]的方法制備粗酶液,主要步驟為:將活化后的枯草芽孢桿菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基中35 ℃培養(yǎng)42 h,5000 r/min離心20 min,所得上清液采用硫酸銨鹽析沉淀,4 ℃過夜,離心所得沉淀物裝入透析袋中,置于Tris-HCl緩沖液中透析,得到去鹽且同時含有堿性蛋白酶和中性蛋白酶的粗酶液。

1.2.3 粗酶水相制取大豆油和蛋白 參照吳海波等[6]的方法,在粗酶液中加入磷酸一氫鈉和磷酸二氫鈉配制成緩沖酶液,在粗酶液堿性蛋白酶活(2000±200) U/mL,中性蛋白酶活(1500±200) U/mL時,加入膨化豆粉,使膨化豆粉:酶液比為1∶8 g/mL,在55 ℃,起始pH10時酶解6 h,90 ℃加熱10 min滅酶,4 500 r/min離心20 min,得到豆渣、水解液、乳狀液、游離油四層物質(zhì),分別將水解液、乳狀液、游離油從離心管中分離出來,備用。水解液用 2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH4左右,3000 r/min離心15 min得到沉淀的蛋白,將蛋白水洗2次后調(diào)至pH7,冷凍干燥制成粗酶水解大豆蛋白凍干粉。

1.2.4 不同方式破乳 分別采用加熱、添加CaCl2、Alcalase堿性蛋白酶(Alcalase酶)酶解、調(diào)節(jié)等電點方式破乳回收乳狀液中的油,具體工藝如下:

加熱法破乳:取1.2.2中獲得的乳狀液放入燒杯置于90 ℃水浴中加熱反應(yīng)20 min,3000 r/min離心20 min后回收乳狀液中的游離油。

添加CaCl2法破乳:向1.2.2乳狀液中添加CaCl2,使CaCl2濃度為0.08 mol/L,70 ℃條件下加熱攪拌(300 r/min)30 min,3000 r/min離心20 min后回收乳狀液中的游離油[12]。

Alcalase酶解破乳:將裝有乳狀液的燒杯置于55 ℃的水浴鍋中,添加2%(w/w)Alcalase堿性蛋白酶,pH9條件下酶解30 min,3000 r/min離心20 min后回收乳狀液中的游離油[13]。

等電點方式破乳:將加熱至50 ℃的乳狀液用2 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)至pH4并保持30 min,3000 r/min離心20 min后回收乳狀液中的游離油[12]。

1.2.5 有機溶劑浸提制油 參考吳海波等[14]的方法將大豆粉碎并過100目篩,豆粉與正已烷按料液比1∶6 g/mL混合,55 ℃條件下連續(xù)浸提6 h后,將油與溶劑混合物置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮至無溶劑蒸出,再用氮氣吹干油中殘余溶劑,所得油收集保存待用。

表1 不同破乳方式所得大豆油的色澤Table 1 Color of soy oil obtained by different demulsification methods

1.2.6 Alcalase酶水解豆粉提取蛋白 參考吳海波等[14]的方法,采用Alcalase堿性蛋白酶,將1.2.1中所得大豆粉在料水比1∶6.5 g/mL,加酶量2%(w/w),酶解溫度57 ℃,pH9.5時酶解3 h,再按1.2.2的方法處理水解液制備Alcalase酶解大豆蛋白凍干粉。

1.2.7 回收油的理化性質(zhì)分析 將溶劑浸提油以及各破乳方式回收油分別進行色澤、酸值、過氧化值、碘值、皂化值的檢測。油脂色澤檢驗參照GB/T 22460-2008;油脂酸價檢驗參照GB 5009.229-2016;油脂過氧化值檢驗參照GB 5009.227-2016;油脂碘值檢驗參照GB/T 5532-2008;油脂皂化值檢驗參照GB/T 5534-2008。

1.2.8 油的脂肪酸組成分析 采用氣相色譜檢測溶劑浸提油和各破乳方式回收油的脂肪酸組成。

油的甲酯化:借鑒朱云等[16]的方法,稱取50 mg大豆油樣品置于容量瓶中,加入4 mL異辛烷,加入1 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液0.5 mL,搖勻,再加入1 g一水合硫酸氫鈉,振搖30 s,靜置5 min,取上清液待測。

氣相色譜分析條件:氣相色譜柱CP-88(100 m×0.25 mm×0.2 μm),進樣量1.0 μL,載氣為氮氣,流速為1 mL/min,分流比為20∶1;進樣口溫度為250 ℃,檢測器溫度300 ℃;氫氣流量30 mL/min;空氣流量400 mL/min;升溫程序為初始溫度90 ℃,保持2 min后以20 ℃/min的速度升溫至170 ℃,保持18 min,以4 ℃/min的速度升溫至230 ℃,保持24 min,最后以30 ℃/min的速度升溫至250 ℃,保持10 min。采用外標法對每個油樣進行測定。

1.2.9 水解蛋白苦味值的評定 以奎寧溶液作為標準溶液對粗酶水解蛋白溶液進行苦味評估[17]。以0、8、16、24、32、40 mg/L濃度的奎寧溶液分別對應(yīng)0、1、2、3、4、5苦味分值,分值越高,苦味越強。評定小組由經(jīng)過感官培訓的10人組成。評定員用蒸餾水漱口之后,取濃度10 mg/mL經(jīng)粗酶或Alcalase堿性蛋白酶提取的蛋白溶液適量置于口中片刻后吐出,并與標準液對比,進行評分[18]。

1.2.10 水解蛋白的氨基酸組成測定 將1.2.1中擠壓膨化前的大豆粉、1.2.2中粗酶水解大豆蛋白凍干粉和1.2.5中Alcalase酶解大豆蛋白凍干粉,分別溶于6 mol/L HCl中,110 ℃水解24 h,過濾并真空干燥,溶解后定容至100 mL。以50 μL為上樣量,采用自動氨基酸分析儀檢測,所測結(jié)果以占蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)表示[19]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均進行3次,采用Statistix 8.1軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,比較數(shù)值間差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 各破乳方式回收油的理化特性

2.1.1 回收油的色澤比較 表1顯示溶劑浸提制取的油紅色數(shù)值高于所有破乳回收油,即溶劑浸提油顏色更深,而各破乳方式回收油的色澤一致。溶劑浸提時會將大豆中原有的脂溶性色素物質(zhì)部分溶出,導致油的色澤變深;較高的浸提溫度也會使大豆原料中蛋白質(zhì)與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生色素物質(zhì),在溶劑浸提時溶解于油中[20]。相關(guān)研究表明溶劑浸提以及后期溶劑回收階段長時高溫處理會使油脂發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng),產(chǎn)生共軛二烯類發(fā)光物質(zhì),導致油的顏色進一步加深[21]。

2.1.2 回收油的酸價 酸價標志著油脂的新鮮程度,油脂酸價高說明油中發(fā)生氧化或水解反應(yīng)產(chǎn)生的游離脂肪酸含量高,油的品質(zhì)不新鮮,因此酸價是反映油脂品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標[22]。圖1顯示各破乳方式所得油的酸價均顯著低于溶劑浸提油(P<0.05),四種破乳方式中等電點法破乳回收油的酸價最高,達0.83 mg/g,其次為加熱破乳油,Alcalase酶和CaCl2破乳所得油酸價最低,僅為0.52 mg/g。由于在溶劑浸提和溶劑回收階段,油脂長時間受熱導致甘油三酯發(fā)生氧化、氧化裂解及氧化聚合等劣變反應(yīng),產(chǎn)生較多的氧化和分解產(chǎn)物,如游離脂肪酸[23-24],因此溶劑浸提油酸價最高。粗酶水解豆粉提油階段由于提取介質(zhì)為水,水可以溶解部分游離脂肪酸,導致乳狀液中游離脂肪酸含量低[25]。等電點法破乳時由于HCl的加入,使破乳油體系中H+含量增加,這可能造成采用氫氧化鉀滴定法測定的油脂酸價升高。Alcalase堿性蛋白酶和CaCl2破乳過程中,加熱溫度較低,油脂受熱時間短,因此酸價最低。加熱破乳(90 ℃受熱20 min)由于破乳溫度高于Alcalase堿性蛋白酶法和CaCl2法,因此氧化反應(yīng)加強,破乳油酸價較二者高。Liu等[26]和Hu等[4]分別采用水酶法提取無患子和櫻桃籽油,結(jié)果顯示水酶法提取油的游離脂肪酸含量均低于浸提法,與本文研究結(jié)論一致。

圖1 不同破乳方式所得大豆油的酸價Fig.1 Acid value of soybean oil obtained by different demulsification methods注:不同字母表示數(shù)值間差異顯著(P<0.05),圖2～圖4同。

圖2 不同破乳方式所得大豆油的過氧化值Fig.2 Peroxide value of soybean oil obtained by different demulsification methods

2.1.3 油的過氧化值 過氧化值測定的是油脂中氧化物質(zhì)含量,代表油脂的氧化程度[22],實驗結(jié)果見圖2。溶劑浸提制取的油過氧化值最高,達1.10 μg/g,其次是加熱破乳回收的油,為0.85 μg/g,等電點法次之,Alcalase酶和CaCl2破乳油過氧化值最低(見圖2),僅為0.62 μg/g。脂類氧化程度受多種因素影響,溫度越高,油脂氧化速率越快,生成的過氧化物越多,油脂劣變加重[27];油脂中含氧量越高,氧化速率越快,過氧化值越高[28]。有機溶劑提取大豆油過程中,不僅受熱溫度高,而且時間長,增加了油與氧的接觸時間,因此制取的油過氧化值最高。水酶法提油過程中油滴存在于O/W體系中,氧必須擴散至水相并通過水-油界面才能接近油滴,因此氧化速率較慢,而且酶水解豆粉過程產(chǎn)生的水解蛋白具有一定的抗氧化活性,一定程度抑制了油的氧化[14],因此乳狀液中的油過氧化值較低。加熱破乳溫度較高,因此油的過氧化值高于其他破乳方法;等電點法破乳盡管在較低溫度下進行,但由于酸的加入,增加了油脂體系中H+供體的含量,與油脂氧化過程中的過氧基自由基結(jié)合[29],生成了更多的氫過氧化物,導致油脂的過氧化值增加。Gai等[24]采用水酶法提取連翹籽油,結(jié)果顯示水酶法提取油的過氧化值低于浸提法,與本研究結(jié)論一致。

2.1.4 油的皂化值 皂化值是測定油中游離脂肪酸和甘油酯含量的指標,即為酯值與酸值的總和,結(jié)果見圖3,各破乳方法所得油皂化值均顯著低于浸提油(P<0.05),其主要原因是由于浸提油較高的酸值導致。Latif等[30]分別采用Alcalase堿性蛋白酶、7L中性蛋白酶、Viscozyme復合酶等酶水相提取辣木籽油,發(fā)現(xiàn)各酶提取的油皂化值均低于溶劑浸提油,與本研究結(jié)論一致。

圖3 不同破乳方式所得大豆油的皂化值Fig.3 Saponification value of soybean oil obtained by different demulsification methods

2.1.5 油的碘值 碘值與油脂中脂肪酸的不飽和程度和含量有關(guān)[21],碘值低意味著油中含有的不飽和雙鍵脂肪酸含量少,油脂較穩(wěn)定不易酸敗。如圖4,各破乳方式所得油的碘值均顯著低于溶劑浸提油(P<0.05),但各破乳油間碘值無顯著差異(P>0.05)。水酶法制油由于在水相中進行,乳狀液中的不飽和游離脂肪酸會部分溶解于水中[24],從而導致破乳回收油的碘值較低。

圖4 不同破乳方式所得大豆油的碘值Fig.4 Iodine value of soybean oil obtained by different demulsification methods

因此粗酶水相制取大豆油過程形成的乳狀液經(jīng)各方式破乳回收的油未經(jīng)脫酸、脫色等工藝,其色度、酸值、過氧化值、皂化值、碘值均低于溶劑浸提油,達到國家成品大豆油二級質(zhì)量標準(GB/T 1535-2017),說明粗酶水相提取以及上述破乳方式?jīng)]有降低油的理化性質(zhì),較于溶劑浸提,更好地保持了油的品質(zhì)。

表2 不同破乳方式所得大豆油的脂肪酸組成Table 2 Fat acid compositions of soy oil obtained by different demulsification methods(%)

2.2 不同破乳方式所得大豆油的脂肪酸組成

大豆油由多種脂肪酸構(gòu)成,其中不飽和脂肪酸由亞麻酸、亞油酸和油酸組成,不飽和脂肪酸對于形成細胞結(jié)構(gòu)、合成磷脂、調(diào)節(jié)血壓、降低血清膽固醇、抗癌以及維持人體正常生理代謝具有重要的作用[31-33]。

表2表明破乳回收油與溶劑浸提油各脂肪酸含量存有差異,但脂肪酸組成基本相同,均以不飽和脂肪酸為主,溶劑浸出油、Alcalase酶破乳油、CaCl2破乳油、等電點破乳油、加熱破乳油中總不飽和脂肪酸含量分別為84.42%、84.49%、84.61%、84.45%、84.47%,符合國際法典委員會推薦的食用油標準[34],說明粗酶水相提取的大豆油仍然保持原有營養(yǎng)價值。Hou等[3]和Hu等[4]采用水酶法分別提取山桐子油和櫻桃籽油,結(jié)果顯示水酶法提取油的脂肪酸組成與溶劑浸提油相似,這與本研究結(jié)論一致。

2.3 粗酶水解蛋白的氨基酸組成和風味

大豆蛋白質(zhì)富含人體所需的8種必需氨基酸,是一種能滿足人體生長所需的優(yōu)質(zhì)蛋白[35]。表3顯示粗酶水解蛋白、Alcalase酶解蛋白與原料大豆蛋白氨基酸組成相同,均含有8種必需氨基酸,各必需氨基酸含量與原料豆相近,即粗酶水相提油工藝沒有破壞大豆蛋白的營養(yǎng)價值,這與其他學者的研究結(jié)論一致[36-37]。

表3 酶解蛋白中氨基酸組成(%)Table 3 Amino acid composition of soybean protein hydrolysates(%)

通過對Alcalase酶和粗酶水解蛋白樣品液的品嘗,結(jié)果顯示Alcalase酶解蛋白具有明顯的苦味,為4分,而粗酶水解蛋白呈中度苦,為3分(見圖5)。水解蛋白呈現(xiàn)苦味是由于在水解過程中形成的苦味肽導致[38],而苦味肽的苦味主要來自于其含有的疏水性氨基酸,未經(jīng)水解的蛋白中大部分疏水性氨基酸側(cè)鏈藏在分子內(nèi)部,不接觸味蕾,因此感受不到苦味,一旦蛋白水解,伴隨水解進程,掩藏在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸側(cè)鏈不斷暴露出來,接觸到味蕾,因此感受到苦味[39]。疏水性氨基酸殘基的羧基端肽鍵是Alcalase蛋白酶的主要酶切位點,極易被Alcalase酶識別和水解,從蛋白內(nèi)部暴露出來,因而Alcalase酶解蛋白苦味較重[40],而粗酶中不僅含堿性蛋白酶還含有部分中性蛋白酶[14],導致對疏水氨基酸殘基的識別與水解能力下降,因此暴露出來的疏水氨基酸側(cè)鏈減少,苦味減弱。另外,表3顯示Alcalase酶解蛋白中疏水性氨基酸所占比例高于粗酶水解蛋白,這與它們的苦味強弱結(jié)果一致。

圖5 蛋白的苦味值Fig.5 Bitter value of soybean protein

3 結(jié)論

實驗結(jié)果顯示等電點法、加熱、添加CaCl2、Alcalase酶法破乳油的品質(zhì)均優(yōu)于溶劑浸提油,各破乳油的色澤、酸價、過氧化值、皂化值、碘值均低于溶劑浸提油。其中CaCl2和Alcalase酶法破乳油的品質(zhì)最新鮮,酸值和過氧化值最低,分別為0.52 mg/g、0.62 μg/g,等電點和加熱破乳油受酸和高溫的影響導致酸價和過氧化值高于其他破乳油,分別為0.83 mg/g、0.85 μg/g。各破乳油在色澤、皂化值和碘值方面無顯著性差異(P>0.05)。破乳油脂肪酸組成與溶劑浸提油相同,盡管含量與溶劑浸提油存有差異,但仍以不飽和脂肪酸為主。粗酶提油工藝所得水解蛋白必需氨基酸含量與原料豆相近,苦味值3分,苦味程度低于Alcalase酶解蛋白。本研究顯示破乳油比溶劑浸提油具有更好的品質(zhì),粗酶水解蛋白仍保持大豆蛋白原有的營養(yǎng)價值,這為水酶法制取大豆油技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了一定的科學理論依據(jù)。