曹 萌 牛偉濤 王僧虎 王寶霞 申晨靜

（1邢臺(tái)學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院 河北 邢臺(tái) 054001；2河北省邢棗仁利用技術(shù)創(chuàng)新中心 河北 邢臺(tái) 054001）

酸棗，鼠李科棗屬植物，抗寒，耐旱，耐瘠薄，適應(yīng)性強(qiáng)，在我國中部和南部的省份都有分布，北方較常見[1]。它的果肉營養(yǎng)價(jià)值很高，酸棗仁能夠用作中藥材。邢臺(tái)處于河北省南部，緊靠太行山，地理環(huán)境適合酸棗生長，生產(chǎn)的酸棗質(zhì)量?jī)?yōu)，口味好，是全國最大的酸棗產(chǎn)業(yè)基地，邢臺(tái)縣酸棗種植面積及產(chǎn)量又是邢臺(tái)地區(qū)之最，被傳頌為“邢臺(tái)的酸棗映河北，河北的酸棗映天下”[2]。

近幾年，酸棗主要用于藥用酸棗仁原料，酸棗果肉利用率很低。酸棗果肉內(nèi)含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如多種糖類、礦質(zhì)元素、維生素和酸類物質(zhì)等。酸棗果醋是一種新興的酸棗果肉深加工品，它同時(shí)具有酸棗和食醋的營養(yǎng)和保健功能，含有10種以上對(duì)人體有益的氨基酸和有機(jī)酸，發(fā)展?jié)摿o限。在酸棗果醋的生產(chǎn)工藝中，發(fā)酵微生物能夠直接影響果醋的品質(zhì)和風(fēng)味。劉陽[3]等從柑橘果醋生產(chǎn)原料中篩出酵母菌，并發(fā)現(xiàn)它們能豐富果醋風(fēng)味。彭倩[3]等研究了醋中細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素，證明了細(xì)菌對(duì)醋的發(fā)酵有積極作用，郭冬琴[4]等在橙汁中分離篩選出多種酵母菌，為解決由酵母污染引起的橙汁酸化給予了有效建議。

目前，邢臺(tái)在酸棗果醋方面的研究較少，關(guān)于果醋中微生物的多樣性也鮮有報(bào)道。本文利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)酸棗果醋中的微生物種類進(jìn)行測(cè)定，為從發(fā)酵方面改造酸棗果醋風(fēng)味及營養(yǎng)成分提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料。邢臺(tái)久和農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司野生酸棗醋。

1.2 儀器與藥品。恒溫培養(yǎng)箱，滅菌鍋，顯微鏡，PCR儀，制冰機(jī)，試管，培養(yǎng)皿，接種針；異戊醇，無水乙醇，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基，DNA擴(kuò)增藥品等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 微生物的分離。處理樣品，吸取100μl酸棗果醋和900μl無菌水于無菌EP管中，制成10個(gè)濃度梯度，接著從10-1濃度梯度中用EP管吸取100μl溶液與900μl無菌水，于試管中制成10-2濃度梯度。取300μl水樣于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板和YPD培養(yǎng)基中，用涂布器涂抹均勻，并用封口膜封好。在28℃環(huán)境中培養(yǎng)24～48h。

1.3.2 分離菌株的純培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察菌落，將形態(tài)不同的菌落挑出，分離出單菌落。并擴(kuò)大培養(yǎng)，為下一步PCR擴(kuò)增提供足夠多的菌株。

1.3.3 DNA的提取。細(xì)菌DNA的提取方法參照彭倩[3]等的試驗(yàn)方法，酵母菌DNA提取的詳細(xì)步驟參照郭冬琴[5]的試驗(yàn)方法。

1.3.4 PCR擴(kuò)增。分為細(xì)菌基因擴(kuò)增與酵母菌基因擴(kuò)增。①細(xì)菌基因擴(kuò)增：細(xì)菌的16SrRNA基因擴(kuò)增的引物為通用引物27F和1492R，序列和擴(kuò)增體系見表1；②酵母菌基因擴(kuò)增：序列和PCR擴(kuò)增體系見表2。

表1 細(xì)菌16SrRNA基因擴(kuò)增序列及擴(kuò)增體系

表2 酵母菌基因擴(kuò)增序列及擴(kuò)增體系

1.3.5 PCR產(chǎn)物純化。制得1%瓊脂糖凝膠(含EB 0.5μg/ml)，分別取5μlPCR產(chǎn)物與1μl上樣緩沖液混勻后上樣，用50×TAE電泳緩沖液，電壓60V，電泳40～50min。

1.3.6 PCR產(chǎn)物測(cè)序與分析。檢測(cè)完成后將合格的產(chǎn)物樣品寄送華大基因有限公司(山東青島市黃島區(qū)衡云山路2號(hào)國家海洋基因庫)進(jìn)行16srDNA測(cè)序。并將所測(cè)的16SrRNA基因序列與EzBioCloud/NCBI/Blast數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比較，確定其種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株。經(jīng)過24～48h培養(yǎng)，觀察原液、稀釋10倍、稀釋100倍的樣品，稀釋10倍的培養(yǎng)基中有較多菌落生長。

2.1.1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中篩選的菌株。從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的菌落中，篩選出5種細(xì)菌(見圖1，從左到右依次標(biāo)記為1號(hào)菌株、2號(hào)菌株、3號(hào)菌株、4號(hào)菌株、5號(hào)菌株)，形態(tài)特點(diǎn)記錄見表3。

圖1 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中篩選的5種菌株

表3 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上篩選的5種菌株

2.1.2 YPD培養(yǎng)基菌落中篩選出的菌株。在YPD培養(yǎng)基的菌落中篩選出5種菌株，見圖2(從左到右依次標(biāo)記為Y1號(hào)菌株、Y2號(hào)菌株、Y3號(hào)菌株、Y4號(hào)菌株、Y5號(hào)菌株)，形態(tài)特征記錄見表4。

圖2 YPD培養(yǎng)基中篩選的5種菌株

表4 YPD培養(yǎng)基中篩選的5種菌株

2.2 PCR的提純結(jié)果。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，1～5號(hào)菌株的DNA條帶都在1.5～1.6kb，無雜帶，Y1～Y4號(hào)菌株條帶在1.5kb，Y5號(hào)菌株有雜帶?？赡苁荄NA提取出現(xiàn)問題造成DNA不純，棄用。電泳圖見圖3、圖4。

圖3 菌株1～5電泳圖

圖4 菌株Y1～Y5電泳圖

2.3 測(cè)序結(jié)果與分析。對(duì)菌株1～5、菌株Y1～Y4，9種菌株進(jìn)行DNA測(cè)序，并將所測(cè)的基因序列在EzBioCloud/NCBI/Blast數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比較，確定其種屬[6]。結(jié)果見表5和表6。根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫的比對(duì)，同時(shí)結(jié)合菌落的形態(tài)特征，經(jīng)綜合分析得出，邢臺(tái)久和農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司野生酸棗果醋含有以下微生物：菌株1，醋酸桿菌(AcetobacteriumBalch)，屬于醋酸桿菌屬；菌株2，解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，屬于芽孢桿菌屬；菌株3，嗜酸菌(Acidophilus)，屬于乳酸桿菌屬；菌株4，雙歧桿菌(Bifidobacterium)，雙歧桿菌屬；菌株5，葡糖醋桿菌(Ga.Azotocaptans)，是葡糖醋桿菌屬；Y1，畢赤酵母(Pichiapastoris)，是畢赤酵母屬；Y2，蜜二糖假絲酵母(Candida melibiosica)，是假絲酵母屬；Y3，釀酒酵母，(Saccharomycescerevisiae)，酵母屬；Y4，確定是酵母菌屬，具體種類有待研究。

表5 1～5號(hào)菌株序列比對(duì)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

酸棗果醋中主要的微生物有細(xì)菌和酵母菌，其中細(xì)菌包括醋酸菌、芽孢桿菌、乳酸菌。醋酸菌的作用是將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精，再將酒精氧化為乙酸，同時(shí)還能產(chǎn)生其他酸類物質(zhì)，營造酸性環(huán)境。芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶，水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸，豐富果醋的風(fēng)味，增加色澤。乳酸菌通過自身代謝活動(dòng)能夠產(chǎn)生大量的乳酸，乳酸能夠降低果醋刺激的酸味，改善果醋的口感。酵母菌利用果醋中的葡萄糖生成乙醇，為醋酸發(fā)酵階段提供更多的乙醇，其次，酵母菌還能產(chǎn)生濃郁香氣的風(fēng)味物質(zhì)。酸棗果醋的質(zhì)量和口味受多種微生物的影響，本試驗(yàn)主要探討了細(xì)菌和酵母菌，但查閱文獻(xiàn)可知，也存在小部分霉菌和其他微生物，霉菌的主要作用是降解生物大分子物質(zhì)等，霉菌和其他微生物的作用和種類有待進(jìn)一步研究。