孫亞林 朱紅蓮 劉正位 匡晶 柯衛(wèi)東

摘要??[目的]利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建藕蓮品種（系）鑒定的DNA指紋圖譜，為藕蓮品種鑒定和新品種選育提供技術(shù)支持。[方法]利用SSR標(biāo)記對(duì)9個(gè)蓮藕新品種（系）進(jìn)行鑒定，統(tǒng)計(jì)條帶并進(jìn)行遺傳多樣性分析，選擇核心引物，建立DNA指紋圖譜。[結(jié)果]從45對(duì)引物中篩選到9對(duì)多態(tài)性引物，對(duì)9個(gè)品種（系）擴(kuò)增得到條帶，共擴(kuò)增出52條帶，其中差異條帶32條，多態(tài)性比率為61.54%，擴(kuò)增片段大小為100～400 bp。選出4對(duì)SSR核心引物構(gòu)建9個(gè)藕蓮品種（系）的DNA指紋圖譜。[結(jié)論]藕蓮品種遺傳多樣性水平較低，4對(duì)引物組合所構(gòu)建的DNA指紋圖譜可用于藕蓮品種鑒定。

關(guān)鍵詞??藕蓮;遺傳多樣性;指紋圖譜;SSR標(biāo)記

中圖分類號(hào)??S??645.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

文章編號(hào)??0517-6611（2020）04-0096-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.028

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Construction of Fingerprint Map for Root Lotus Varieties（Lines） by SSR

SUN Ya-lin，ZHU Hong-lian，LIU Zheng-wei et al??（Institute of Vegetable，Wuhan Academy of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430207）

Abstract??[Objective]With the aim to identify root lotus varieties，SSR molecular markers were used to get its DNA fingerprint map.[Method] SSR primers were screened out，the PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were carried out for the 9 root lotus varieties，genetic diversity analysis were performed，and the core primers were selected to set up an identified fingerprint system.[Result]9 pairs of primer with clear band and high polymorphism were selected from 45 pairs of primer.A total of 52 bands were amplified from root lotus varieties，32 bands among them were polymorphic，the percentage of polymorphism band（PPB） was 61.54%.Four core primers were selected out to set up fingerprint of 9 root lotus varieties.[Conclusion]The genetic diversity of root lotus varieties was low，DNA fingerprint map constructed by 4 pairs of primer combinations can he used in the identification of ?root lotus varieties.

Key words??Root lotus;Genetic diversity;Fingerprint map;SSR markers

蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）為蓮科蓮屬多年生大型水生草本植物，根據(jù)蓮的用途，可將蓮分為3個(gè)類型，即藕蓮、子蓮、花蓮，以采收肥大的地下根狀莖為目的的稱為藕蓮，藕蓮在我國栽培面積最大，是我國特色的水生經(jīng)濟(jì)作物。隨著藕蓮新品種的日益增多，加強(qiáng)品種識(shí)別與鑒定，確保品種的真實(shí)性和純度，優(yōu)化種植區(qū)域品種合理布局，提高生產(chǎn)效率具有重要意義。在生產(chǎn)過程中，品種鑒別主要靠植株高矮、花期、花色、藕的熟性、節(jié)間形狀等來判斷[1]，由于受到不同產(chǎn)區(qū)氣候、土壤、光照等影響，因此鑒定起來比較困難。品種鑒定不詳不利于蓮藕新品種的推廣，阻礙了蓮產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

SSR是一種基于PCR的分子標(biāo)記，具有操作簡單、豐富多態(tài)性、重演性高且呈共顯性遺傳而被廣泛用于遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定等方面[2]。該研究擬通過對(duì)我國主要推廣的藕蓮品種（系）進(jìn)行鑒定，構(gòu)建藕蓮品種（系）的指紋圖譜，為藕蓮種苗認(rèn)證和DUS測試過程中近似品種的鑒定提供參考。

1??材料與方法

1.1??材料

試驗(yàn)所有材料為我國主要推廣的9個(gè)藕蓮新品種（系）：鄂蓮5號(hào)、鄂蓮6號(hào)、鄂蓮7號(hào)、鄂蓮8號(hào)、鄂蓮9號(hào)、鄂蓮10號(hào)、新5號(hào)、544蓮、小白胖，均來自國家種質(zhì)武漢水生蔬菜資源圃，品種（系）詳細(xì)信息見表1。

1.2??基因組DNA提取

各材料分別取幼葉1 g，采用CTAB法提取各材料的DNA，利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA質(zhì)量，并用分光光度計(jì)檢測DNA的濃度和純度，-20 ?℃低溫下保存待用。

1.3??PCR擴(kuò)增與電泳檢測

采用公開發(fā)表的45對(duì)SSR引物 [3-6]，引物由上海生工合成（表2），PCR反應(yīng)體系：2×Taq mixture 5 μL，DNA模板1 μL，引物（上下游）1 μL，ddH2O 3 μL，共10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物用6%變性PAGE檢測，0.5×TBE電泳緩沖液，恒功率60 W，電泳1.5 h，電泳完畢采用銀染顯色，觀察并照相記錄。

1.4??數(shù)據(jù)分析

只統(tǒng)計(jì)清晰、再現(xiàn)性強(qiáng)的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物按同一位點(diǎn)條帶有或無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0;統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性條帶比率（PPB）和多態(tài)性信息量（PIC），PIC=l-fi2，其中fi為i位點(diǎn)的等位基因頻率[7] ，采用NTSYS-pc version 2.10軟件計(jì)算Jaccard相似指數(shù)，按照UPGMA法進(jìn)行聚類。 統(tǒng)計(jì)各引物的多態(tài)性位點(diǎn)比例;選擇多態(tài)性最高的引物組合構(gòu)建藕蓮品種的DNA指紋圖譜。

2??結(jié)果與分析

2.1??品種遺傳多樣性分析

從45對(duì)SSR引物中，篩選到9對(duì)多態(tài)性好、帶型清晰的引物用于藕蓮品種鑒定。9對(duì)引物共擴(kuò)增出52條帶，其中差異條帶32條，多態(tài)性比率為61.54%，擴(kuò)增片段大小為100～400 bp。平均每個(gè)引物組合擴(kuò)增的多態(tài)形條帶3.56條，最多的為10條。多態(tài)性信息量（PIC）變化幅度較大，最低0.198，NnSSR07引物的PIC最高，為0.642（表3）。部分引物在9個(gè)藕蓮品種（系）中的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2??品種聚類分析

根據(jù)9對(duì)引物組合的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)9個(gè)藕蓮品種（系）進(jìn)行聚類分析（圖2），Jaccard相似系數(shù)為0.573～0.972，平均相似系數(shù)為0.768。利用非加權(quán)組平均法（UPGMA）對(duì)供試材料進(jìn)行聚類分析，在相似系數(shù)0.580處可以將藕蓮品種（系）分為2個(gè)類群，第一類群為544蓮和小白胖蓮。第二類群為鄂蓮5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)、10號(hào)和新5號(hào)，在相似系數(shù)為0.620處可以將其分為2個(gè)亞組，第一亞組為鄂蓮5號(hào)、6號(hào)、8號(hào);第二亞組為鄂蓮7號(hào)、9號(hào)、10號(hào)和新5號(hào)。

聚類分析結(jié)果表明選用的9對(duì)引物能較好地反映9份藕蓮品種（系）的親緣關(guān)系，在相似系數(shù)0.580附近將9份藕蓮品種（系）分成2個(gè)類群，遺傳多樣性相對(duì)較低，品種之間的親緣關(guān)系與親本來源有關(guān)，部分品種親緣關(guān)系較為接近，說明部分品種的親本來源較為狹窄。

2.3??指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)每個(gè)品種（系）DNA擴(kuò)增圖譜中SSR標(biāo)記的特異性條帶的有無，由l和0形成的有序數(shù)字串構(gòu)成某個(gè)品種（系）的特征指紋圖譜。表4列出了9份藕蓮品種（系）的指紋圖譜。從擴(kuò)增出的32條特征條帶中選擇了25條譜帶將供試9份藕蓮品種（系）完全區(qū)分開，這25條帶是NnSSR07、NS050、NS012、Nelumbo-13這4對(duì)引物擴(kuò)增得到的。

3??小結(jié)與討論

3.1??主要蓮藕品種的代表性??藕蓮在我國栽培歷史悠久，我國是藕蓮的主要生產(chǎn)國和消費(fèi)國。截至2016年，我國蓮栽培面積為40萬hm2，產(chǎn)量為1 210.4萬t[8]，藕蓮是我國特色水生蔬菜，在蔬菜周年供應(yīng)中占據(jù)重要地位。我國藕蓮品種選育開始于20世紀(jì)80年代，經(jīng)過30多年的發(fā)展，新品種選育取得顯著成績，截至2018年，我國選育藕蓮新品種達(dá)14個(gè)，目前市場上推廣的藕蓮品種絕大部分為鄂蓮系列，與傳統(tǒng)品種相比，新品種產(chǎn)量提高了30%～50%，極大地促進(jìn)了我國蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[9]。

該試驗(yàn)中所選用的9個(gè)藕蓮品種（系）均為武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育，這些品種中栽培面積最大的是鄂蓮5號(hào)，產(chǎn)量最高的品種是鄂蓮9號(hào)，熟性最早的是鄂蓮10號(hào)，該試驗(yàn)所選的9個(gè)品種（系）涵蓋了不同節(jié)型（長節(jié)、中節(jié)、短節(jié)）、不同熟性（早、中、晚熟）及不同熟食口感（脆、中、粉），這些品種在我國不同產(chǎn)區(qū)均有種植，具有廣泛的代表性。

3.2??SSR標(biāo)記在品種鑒定中的應(yīng)用

SSR也稱微衛(wèi)星序列，因其具有等位變異高、共顯性遺傳、穩(wěn)定性好、操作簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，成為目前植物分子指紋圖譜研究中應(yīng)用最多的遺傳標(biāo)記，已經(jīng)成功運(yùn)用于棉花[10]、玉米[11]、煙草[12]、梨[13]、甘薯[14]等植物的指紋圖譜構(gòu)建。在蓮研究領(lǐng)域，SSR技術(shù)已運(yùn)用于遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建，薛建華等[15]利用17對(duì)SSR引物作為72個(gè)花蓮品種的DNA指紋鑒定條碼，結(jié)果表明最少8對(duì)引物組合可完全區(qū)分開68個(gè)品種，有4個(gè)品種組內(nèi)全部17對(duì)引物均不能區(qū)分。2008年，全志武等[16]利用SSR引物對(duì)10個(gè)藕蓮品種進(jìn)行了圖譜構(gòu)建，用4對(duì)SSR引物可以區(qū)分10個(gè)藕蓮品種。為滿足生產(chǎn)與社會(huì)多元化的需求，一批優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的藕蓮新品種被選育并推廣，也有一批老品種被淘汰，原有SSR指紋圖譜已無法對(duì)現(xiàn)有品種進(jìn)行有效鑒定。不同引物的有限組合可以大大提高引物的鑒別能力，該研究利用篩選出9對(duì)SSR引物組合對(duì)9個(gè)藕蓮品種（系）進(jìn)行了遺傳多樣性分析，并構(gòu)建了品種的指紋圖譜。隨著品種數(shù)量的進(jìn)一步增加，這些引物組合的鑒別能力可能會(huì)逐漸降低，因此需要篩選更多的多態(tài)性好的引物對(duì)，用于不斷選育出的藕蓮新品種的SSR指紋庫的構(gòu)建。

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