缺血性心臟病是常見的心血管疾病，其中紫紺型先天性心臟病患者長(zhǎng)期處于嚴(yán)重乏氧狀態(tài)[1-3]，在手術(shù)中進(jìn)行體外循環(huán)時(shí)提倡高濃度給氧，以保證氧供給，但高濃度補(bǔ)氧會(huì)加重心肌損害，不利于心肌功能恢復(fù)[4]。調(diào)節(jié)心肌血氧平衡、降低心肌負(fù)荷可緩解缺血再灌注后心肌損傷[5]。慢性缺氧處理是降低心肌缺血再灌注損傷的有效方法，心肌細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列慢性缺氧適應(yīng)性變化，但具體機(jī)制尚未明確。本研究探討慢性缺氧對(duì)心肌耐受缺血再灌注損傷的影響，以期為缺血性心臟病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、設(shè)備及試劑

60只體質(zhì)量為140～180 g的雄性SD大鼠由成都醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高頻彩色超聲儀(Vevo 2100)、呼吸機(jī)(DH-150)購(gòu)自加拿大VisualSonic公司；Langendorff灌流系統(tǒng)、多功能生理記錄儀、全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)BIOPAC公司。戊巴比妥鈉、肝素鈣購(gòu)自江蘇常州千紅生化制藥股份有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒購(gòu)自重慶川東化工有限公司化學(xué)試劑廠。

1.2 動(dòng)物分組

將60只SD大鼠隨機(jī)等分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組30只；再根據(jù)在體實(shí)驗(yàn)及離體實(shí)驗(yàn)分別將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組隨機(jī)等分，分為在體實(shí)驗(yàn)組、在體對(duì)照組、離體實(shí)驗(yàn)組和離體對(duì)照組，每組15只。4組大鼠均給予同質(zhì)飼料及飲用水，喂養(yǎng)28 d。實(shí)驗(yàn)組大鼠在模擬海拔5 000 m的動(dòng)物低壓低氧艙(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供)中生活，艙內(nèi)條件：大氣壓54 kPa，氧分壓11.33 kPa，溫度25 ℃。動(dòng)物在艙內(nèi)自由攝食飲水，每3～4 d將艙內(nèi)氣壓調(diào)整1次，至相當(dāng)于海拔3 000 m，時(shí)間1 h。對(duì)照組大鼠在正常氧環(huán)境中喂養(yǎng)。

1.3 構(gòu)建在體缺血再灌注損傷模型

予以大鼠面罩吸氧，連接呼吸機(jī)，頻率50次/min，潮氣量2 mL/kg，吸呼比1∶2。備皮后，經(jīng)左側(cè)第3肋間隙進(jìn)入并撐開胸腔，仔細(xì)暴露心臟并辨別出左冠狀動(dòng)脈前降支，將帶針縫線從前降支下穿過，在血管上方放置直徑1～2 mm聚乙烯管后打結(jié)。結(jié)扎后遠(yuǎn)端血管支配的區(qū)域顏色變蒼白，表明成功結(jié)扎血管并致心肌組織缺血。0.5 h后剪斷縫線，撤去聚乙烯管，觀察心臟缺血區(qū)域顏色恢復(fù)為粉紅色，關(guān)閉胸腔、復(fù)蘇大鼠。

造模24 h后行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，隨后立即開腹，通過下腔靜脈注射100 IU肝素鈣并采血5 mL以檢測(cè)心肌酶，迅速摘除心臟，拭凈血液后稱重。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)在體大鼠心功能

造模前24 h及造模后24 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(2 mL/kg)麻醉大鼠，對(duì)大鼠稱重并固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，采用高頻彩色超聲儀13～24 MHz超聲探頭(MS250)檢測(cè)大鼠心率(HR)、舒張期室間隔厚度(IVSd) 、收縮期室間隔厚度(IVSs)、舒張期左室后壁厚度(LVPWd)、收縮期左室后壁厚度(LVPWs)、左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)，計(jì)算出每搏輸出量(SV)，SV=LVEDV-LVESV。

1.5 構(gòu)建離體心臟再灌注損傷模型

連接Langendorff灌流系統(tǒng)和多功能生理記錄儀，將壓力換能器與球囊相連接。向K-H溶液中通入95%O2、5%CO2混合氣體，使K-H溶液pH值維持在7.4左右，用K-H溶液沖洗整個(gè)Langendorff灌流系統(tǒng)。稱重SD大鼠，3%戊巴比妥鈉(2 mL/kg)腹腔注射麻醉后開腹，經(jīng)下腔靜脈注射100 IU肝素鈣后取出心臟，在4 ℃ K-H溶液中洗凈殘余血液，迅速掛在Langendorff 灌流系統(tǒng)中，以80 cmH2O壓力行主動(dòng)脈逆行灌注。待心臟復(fù)跳后，將壓力換能器和球囊經(jīng)左心耳放入左心室，緩緩向球囊內(nèi)注水，使左室舒張末期壓力維持在4～10 mmHg，記錄心室內(nèi)壓力變化。待心跳穩(wěn)定、心率>200次/min并持續(xù)20 min后，記錄心臟灌流液流出量，取500 μL灌流液置于EP管中，于-80 ℃冰箱保存，停止心臟灌注。30 min后打開灌流系統(tǒng)進(jìn)行再灌注，每10 min記錄一次心室內(nèi)壓力，60 min時(shí)取500 μL灌流液于EP管中，于-80 ℃冰箱保存待測(cè)，并摘除心臟。

1.6 心肌TTC染色和心肌梗死面積評(píng)估

TTC染色步驟：對(duì)心室進(jìn)行切片，厚度約為0.5 cm，將心肌片放入1% TTC溶液中，37 ℃恒溫水浴加熱20 min、10%多聚甲醛固定30 min后取出照相。采用ImageJ軟件測(cè)量，心肌梗死面積=心肌片梗死面積/心室肌總面積。

1.7 LDH和CK-MB活性檢測(cè)

將血液標(biāo)本及灌流液標(biāo)本3 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，取上清液作為檢測(cè)樣品。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH和CK-MB活性，操作嚴(yán)格按照試劑盒檢測(cè)說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，經(jīng) Kolmogorov-SmirnovD檢驗(yàn)分析均為正態(tài)分布，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性缺氧對(duì)在體心臟缺血再灌注損傷的影響

2.1.1 在體實(shí)驗(yàn)組與在體對(duì)照組大鼠缺血再灌注損傷前后超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較 缺血再灌注前，在體實(shí)驗(yàn)組HR、LVESV均明顯大于在體對(duì)照組(P均<0.05)，IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVFS、LVEDV、SV均明顯小于在體對(duì)照組(P均<0.05)。在體實(shí)驗(yàn)組和在體對(duì)照組經(jīng)歷缺血再灌注后大鼠的心功能均有不同程度損傷。在體實(shí)驗(yàn)組缺血再灌注后HR、IVSd、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEDV、LVESV均有不同程度上升(P均<0.05)，而LVEF、LVFS、SV有不同程度下降(P均<0.05)；在體對(duì)照組缺血再灌注處理后HR、LVEDV、LVESV有不同程度上升，IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVFS、SV較缺血再灌注前明顯下降(P均<0.05)。 缺血再灌注后，在體實(shí)驗(yàn)組HR、IVSs、LVPWd、LVPWs、LVEF、LVFS均明顯大于在體對(duì)照組(P均<0.05)，IVSd、LVEDV、LVESV、SV均明顯小于在體對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

2.1.2 在體實(shí)驗(yàn)組與在體對(duì)照組大鼠缺血再灌注損傷后心肌梗死面積及血清心肌酶水平比較 TTC染色后可見實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌梗死面積較對(duì)照組明顯減少[(0.07±0.02)%對(duì)(0.16±0.01)%，P<0.05]，見圖1。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組CK-MB活性明顯降低[(176.14±20.82)IU/L對(duì)(658.83±74.18)IU/L，P<0.05]；兩組LDH活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(610.86±72.20)IU/L對(duì)(574.67±63.35)IU/L]。

2.2 慢性缺氧對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷的影響

2.2.1 離體實(shí)驗(yàn)組與離體對(duì)照組大鼠離體心臟缺血再灌注損傷前后心室壓力指標(biāo)比較 壓力換能器測(cè)定缺血再灌注損傷前后心室內(nèi)壓力變化指標(biāo)大鼠左室發(fā)展壓(LVDP)、左室舒張末期壓力(LVEDP)變化情況，以及最大收縮速率[max(dp/dt)]、最大舒張速率[min(dp/dt)]的變化。缺血再灌注損傷前，離體實(shí)驗(yàn)組LVDP低于離體對(duì)照組(P均<0.05)，兩組LVEDP的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)歷缺血再灌注損傷，離體實(shí)驗(yàn)組及離體對(duì)照組LVDP均較缺血再灌注前下降，LVEDP均較缺血再灌注前上升(P均<0.05)；缺血再灌注損傷后，離體實(shí)驗(yàn)組LVDP明顯高于離體對(duì)照組，LVEDP明顯低于離體對(duì)照組，(P均<0.05)。缺血再灌注損傷前，離體實(shí)驗(yàn)組反映心室內(nèi)壓力變化快慢的指標(biāo)max(dp/dt)、min(dp/dt)均明顯低于離體對(duì)照組(P均<0.05)；經(jīng)歷缺血再灌注損傷后離體實(shí)驗(yàn)組及離體對(duì)照組max(dp/dt)、min(dp/dt)均有不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；缺血再灌注損傷后，離體實(shí)驗(yàn)組max(dp/dt)、min(dp/dt)均明顯高于離體對(duì)照組(P均<0.05)。見表2。

表1 兩組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較

注：與在體對(duì)照組缺血再灌注前比較，(1)P<0.05；與在體對(duì)照組缺血再灌注后比較，(2)P<0.05；與在體實(shí)驗(yàn)組缺血再灌注前比較，(3)P<0.05

注：灰白色區(qū)域?yàn)樾募」Ｋ绤^(qū)，上圖為在體對(duì)照組，下圖為在體實(shí)驗(yàn)組

表2 缺血再灌注前后兩組大鼠離體心室壓力指標(biāo)比較

注：與離體對(duì)照組缺血再灌注前比較，(1)P<0.05；與離體實(shí)驗(yàn)組缺血再灌注前比較，(2)P<0.05；與離體對(duì)照組缺血再灌注后比較，(3)P<0.05

2.2.2 離體實(shí)驗(yàn)組與離體對(duì)照組組大鼠離體心臟缺血再灌注損傷后心肌梗死面積、LDH活性比較 TTC染色可見實(shí)驗(yàn)組心肌梗死面積較對(duì)照組明顯減少[(0.08±0.01)%對(duì)(0.13±0.02)%，P<0.05]；實(shí)驗(yàn)組LDH活性較對(duì)照組明顯降低[(4.00±0.37)IU/L對(duì)(7.33±0.99)IU/L，P<0.05]。

3 討論

心肌慢性缺氧是紫紺型先天性心臟病、肺源性心臟病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心肌肥厚等疾病的共同病理生理過程，研究慢性缺氧心肌的適應(yīng)性反應(yīng)及機(jī)制，對(duì)上述疾病的治療具有重要意義。

慢性缺氧不僅可以使心肌細(xì)胞超纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致心肌重構(gòu)及心臟收縮功能下降，還可以促進(jìn)血管活性物質(zhì)分泌，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，使肺動(dòng)脈壓力升高，導(dǎo)致右心衰竭，引起慢性缺氧相關(guān)性心肌病。心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，缺氧會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡增加，但心肌細(xì)胞有較強(qiáng)的自我適應(yīng)及修復(fù)能力，可在應(yīng)激狀態(tài)下促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，維持心肌細(xì)胞數(shù)量，保存心臟功能。1986年，Murry等[6]首次提出慢性缺氧適應(yīng)是心肌一種重要的自我適應(yīng)能力，缺氧預(yù)處理可預(yù)防缺血和缺血再灌注損傷等對(duì)心肌造成的傷害。慢性缺氧時(shí)心肌細(xì)胞產(chǎn)生一系列結(jié)構(gòu)、功能、代謝變化，能增強(qiáng)心肌對(duì)急性缺氧導(dǎo)致的心肌梗死、收縮功能不良、室性心律失常等的耐受力[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧可增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)及線粒體數(shù)量，提高心肌組織供血及能量合成，使心肌能最大程度利用有限氧[9-10]。肖穎彬等[11]研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧時(shí)，心肌細(xì)胞可調(diào)節(jié)代謝相關(guān)激酶的活性，增加葡萄糖利用并減少脂肪酸利用；Peng等[12]研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧大鼠心肌細(xì)胞可以通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。通過以上多種適應(yīng)機(jī)制，慢性缺氧增強(qiáng)心肌細(xì)胞耐受應(yīng)激的能力。

再灌注雖可以增加缺血心肌的血流，挽救心肌，但同時(shí)又可造成不可逆轉(zhuǎn)的附加損傷[13]。研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的缺血再灌注損傷會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡及功能障礙[14]，探究缺血再灌注損傷機(jī)制，對(duì)減少心肌損傷、降低缺血性心臟病的發(fā)生有重要意義。再灌注損傷的具體機(jī)制尚未明確，很多學(xué)者認(rèn)為其主要通過氧化應(yīng)激、線粒體功能異常導(dǎo)致心肌能量代謝異常和炎性反應(yīng)，從而造成心肌細(xì)胞功能障礙[15]。研究表明，缺血再灌注損傷時(shí)氧自由基增多[16]，心肌細(xì)胞的生物膜結(jié)構(gòu)受到破壞，蛋白質(zhì)功能受到抑制，其核酸和染色體也受到損害[17]，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能改變，引起心肌損傷。同時(shí)，缺血再灌注損傷可使線粒體功能受損，細(xì)胞色素氧化酶活性受抑，氧自由基生成增加[18]。缺血時(shí)心肌細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)迅速減少，再灌注時(shí)由于氧自由基的損傷，阻礙了心肌細(xì)胞氧化磷酸化的過程[19]，雙重作用下心肌耐受能力降低，從而造成細(xì)胞損傷。

臨床上缺血再灌注損傷比較常見，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)、非體外循環(huán)下冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)等均發(fā)生了在體缺血再灌注損傷的病理生理過程。常規(guī)體外循環(huán)下心臟手術(shù)停跳復(fù)跳過程是典型的缺氧-復(fù)氧過程，相當(dāng)于離體缺血再灌注損傷的病理生理過程。因此，本研究分別制作了大鼠在體、離體缺血再灌注損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)，慢性缺氧預(yù)處理能使缺血再灌注損傷后心肌梗死面積減少，心功能改善，從而減少心肌細(xì)胞在缺血再灌注后的損傷，維持心肌細(xì)胞更高的存活率。研究表明，再灌注時(shí)氧分壓越高，產(chǎn)生的氧自由基就越多，對(duì)心肌的損傷也越大；低氧分壓能使再灌注末的缺血心肌產(chǎn)生較少的氧自由基，顯著提高細(xì)胞抗氧化酶活性，使線粒體等超微結(jié)構(gòu)的損害減輕[20]。因此，我們認(rèn)為低氧減輕缺血再灌后心肌的損傷是由于低氧狀態(tài)下氧自由基生成減少，但其中涉及的具體信號(hào)通路尚未明確，需進(jìn)一步研究。