王馨云，謝 晶

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)），上海 201306）

大眼金槍魚又稱鮪魚、吞拿魚，具有高蛋白、低脂肪等特點(diǎn)，同時(shí)含有大量不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)，深受消費(fèi)者的喜愛[1-2]。大眼金槍魚富含很高的二十碳五烯酸（icosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoci acid，DHA）等營養(yǎng)成分。楊金生等[3]對(duì)黃鰭金槍魚、藍(lán)鰭金槍魚和鰹魚的DHA和EPA含量進(jìn)行測(cè)定，其DHA與EPA相對(duì)含量之和超過30%。鄒盈等[4]發(fā)現(xiàn)大眼金槍魚、黃鰭金槍魚和藍(lán)鰭金槍魚的不飽和脂肪酸含量分別占總脂肪酸的64.30%、66.28%和89.03%，其中EPA和DHA含量較高。但在冷藏過程中，脂肪氧化以及微生物的侵染[5-6]導(dǎo)致金槍魚營養(yǎng)價(jià)值降低，品質(zhì)難以得到保證。學(xué)者們對(duì)金槍魚脂肪酸等營養(yǎng)成分進(jìn)行了不少的研究，但對(duì)冷藏過程金槍魚的脂肪酸變化卻鮮有報(bào)道。

水分是水產(chǎn)品中含量最高的化學(xué)組分，水分含量是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。水分含量和分布狀態(tài)在水產(chǎn)品冷藏過程中呈動(dòng)態(tài)變化，是決定水產(chǎn)品品質(zhì)、風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)和貨架期的重要因素[7]。根據(jù)水分的狀態(tài)不同可分為結(jié)合水（與蛋白質(zhì)等大分子緊密結(jié)合的水分）、不易流動(dòng)水（肌原纖維內(nèi)及間隙的水）和自由水（纖維束外水）[8]。傳統(tǒng)測(cè)量方法操作復(fù)雜，且只能測(cè)出水分總含量，無法確定水分的狀態(tài)及分布情況。而低場(chǎng)核磁共振（low-field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）技術(shù)所測(cè)的橫向弛豫時(shí)間T2的變化規(guī)律可反映水分的遷移情況及各狀態(tài)水分含量的變化，它作為一種快速、準(zhǔn)確、無損、非侵入的技術(shù)已逐步應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、高分子材料、醫(yī)學(xué)以及水產(chǎn)品行業(yè)[9-10]。Wang Xinyun[11]和Al-Habsi[12]等研究了水產(chǎn)品貯藏過程中水分變化，隨著貯藏時(shí)間的延長，在微生物的作用下，魚肉組織微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞，水分發(fā)生遷移，不易流動(dòng)水向自由水轉(zhuǎn)變，使水產(chǎn)品品質(zhì)下降，證明了水產(chǎn)品的品質(zhì)變化與水分遷移有一定關(guān)系。Greiff等[13]借助LF-NMR技術(shù)分析不同濃度添加劑對(duì)鱈魚魚糜蛋白結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著添加劑濃度增加，不易流動(dòng)水（T21）和自由水（T22）含量逐漸增大，蒸煮損失率和持水力降低，這是由于肌肉纖維內(nèi)的水分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用被抑制，表明LF-NMR技術(shù)可用于評(píng)價(jià)添加劑對(duì)水產(chǎn)品品質(zhì)的影響。Geng Shaote等[14]應(yīng)用LF-NMR技術(shù)分析干海參復(fù)水過程的水分變化，根據(jù)T2的變化測(cè)定水分含量并推斷預(yù)滲時(shí)間分別為24 h和96 h，通過主成分分析（principal component analysis，PCA）得到干燥海參的復(fù)水比、硬度、咀嚼性之間呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，并在PCA得分圖上能明顯區(qū)分干制和鹽制海參。說明利用LF-NMR技術(shù)可間接檢測(cè)水產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)特性，其結(jié)果與水產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)參數(shù)的結(jié)果一致。

目前，國內(nèi)外學(xué)者已有應(yīng)用LF-NMR技術(shù)檢測(cè)水產(chǎn)品品質(zhì)的研究[15-16]，但鮮有針對(duì)水產(chǎn)品脂肪酸變化與水分遷移之間關(guān)系的研究。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M家庭貯藏（0、4 ℃）過程中金槍魚的品質(zhì)變化，利用LF-NMR技術(shù)研究金槍魚在冷藏過程中水分遷移與脂肪酸變化的相關(guān)性，為水產(chǎn)品的快速無損檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料為真空凍藏于-55 ℃的大眼金槍魚背部肌肉，購自浙江豐匯遠(yuǎn)洋漁業(yè)有限公司。

硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、三氯乙酸、甲醇、氯仿（均為分析純） 生工生物工程有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品十九碳酸甲酯（C19:0） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Aqualab 4TE Duo水分活度儀 美國Decagon公司；PQ001 LF-NMR分析儀 上海紐邁公司；XB220A-SCS分析天平 北京普利賽斯科技有限公司；H-2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計(jì) 美國尤尼柯儀器有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；PB-10 pH計(jì) 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 金槍魚預(yù)處理

將購得的金槍魚塊放在0 ℃恒溫冰箱解凍12 h后，快速分割每塊質(zhì)量為100.00 g，用聚乙烯保鮮袋分裝（1 塊/袋）后，立即貯藏于0、4 ℃恒溫冰箱。每天測(cè)定金槍魚的pH值、水分活度（water activity，aw）、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、TBA值、橫向弛豫時(shí)間T2。每隔3 d測(cè)定金槍魚的脂肪酸含量、核磁偽彩成像圖。每組做3 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 pH值測(cè)定

稱取剁碎金槍魚肉5.00 g，加入45 mL蒸餾水?dāng)嚩恫㈧o置1 h，取上清液，用pH計(jì)測(cè)定其pH值。

1.3.2.2 aw測(cè)定

取1.00 g金槍魚片置于樣品杯中，然后將樣品杯放置于水分活度儀中。測(cè)量溫度為25 ℃，持續(xù)20 s，在穩(wěn)定時(shí)測(cè)定aw。

1.3.2.3 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定參照GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》。

1.3.2.4 TBA值測(cè)定

采用李念文[2]和Cai Luyun[17]等的方法，并略有改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取5 g已絞碎魚肉，加入15 mL 20 g/100 mL三氯乙酸溶液和10 mL蒸餾水，勻漿60 s，靜置1 h后過濾。濾液用蒸餾水定容至50 mL，取5 mL濾液，加入5 mL 0.02 mol/L TBA溶液，沸水浴中反應(yīng)20 min后用流動(dòng)水冷卻5 min，在532 nm波長處測(cè)定吸光度，TBA值按下式計(jì)算。

TBA值/（mg/100 g）＝7.8×A532nm

1.3.2.5 橫向弛豫時(shí)間T2和核磁成像測(cè)定

橫向弛豫時(shí)間T2和核磁成像（magnetic resonance imaging，MRI）參考Wang Shuo等[18]的測(cè)定方法，并稍加修改。將約10 g樣品保鮮膜封閉包裝，防止水分蒸發(fā)，放入線圈直徑為70 mm的核磁管中進(jìn)行測(cè)定。質(zhì)子共振頻率21 MHz，磁體強(qiáng)度0.55 T，磁體溫度32 ℃。選擇CPMG序列測(cè)定魚肉樣橫向弛豫時(shí)間T2，主要參數(shù)設(shè)置為：射頻信號(hào)頻率偏移量（O1）＝171 005.93 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)（TD）＝400 004，90°脈寬（P1）＝17.00 μs，180°脈寬（P2）＝32.00 μs，采樣頻率（SW）＝100 kHz，回波時(shí)間（TE）＝0.5 ms，采樣等待時(shí)間（Tw）＝4 000 ms，射頻延時(shí)（RFD）＝0.08 ms，模擬增益（RG1）＝20.0 db，數(shù)字增益（DRG1）＝6 db，累加次數(shù)（NS）＝2，回波數(shù)（NECH）＝8 000。使用NMRAS分析軟件采集信號(hào)，反演后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。MRI測(cè)定魚肉的質(zhì)子密度圖譜，得到的質(zhì)子密度圖通過Image Evaluation軟件測(cè)定圖像的灰度。

1.3.2.6 脂肪酸含量測(cè)定

稱取0.2 g樣品，加2 mL甲醇、4 mL氯仿，25 ℃ 180 r/min振搖20 min，加入2 mL去離子水，漩渦2 min，再1 000 r/min離心10 min，取下層清液至新離心管，氮?dú)獯蹈?。加? mL正己烷、25 μL 10 mg/mL C19:0內(nèi)標(biāo)，漩渦振蕩2 min，加入3 mL 0.4 mol/L KOH-甲醇溶液，漩渦振蕩1 min。37 ℃水浴反應(yīng)30 min后，加入2 mL去離子水，漩渦振蕩2 min，靜置分層，取上清液至新離心管，氮?dú)獯蹈?。再加?00 μL正己烷，漩渦振蕩2 min，靜置，取上清液至進(jìn)樣小瓶中。

氣相色譜參數(shù)：色譜柱：DB-5（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣溫度：270 ℃；分流比：5∶1；載氣：氦氣（99.999%）；流量：1 mL/min。柱溫70 ℃保持5 min，以25 ℃/min升至200 ℃，再以2 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。接口溫度：280 ℃；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；電離方式：電子電離（正離子模式），70 eV；掃描方式：全掃描；分子質(zhì)量范圍：33～500 Da。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin 8.6軟件繪圖。采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA），通過Pearson相關(guān)系數(shù)法分析LF-NMR的橫向弛豫時(shí)間T2與脂肪酸含量的相關(guān)性，顯著性水平設(shè)置為α＝0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷藏期間金槍魚的pH值變化

圖 1 金槍魚在0 ℃和4 ℃貯藏期間pH值的變化Fig. 1 Changes in pH of tuna during storage at 0 or 4 ℃

如圖1所示，在貯藏前期（0～2 d）pH值呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，是由于金槍魚在僵直期肌肉組織中發(fā)生糖酵解反應(yīng)，大量生成乳酸等酸性物質(zhì)，從而使pH值下降。2 d后，兩組金槍魚pH值呈上升趨勢(shì)，在第6天0 ℃貯藏條件下pH值上升至6.9，4 ℃貯藏條件下pH值達(dá)到7.2。主要由于在微生物和酶的作用下，蛋白質(zhì)被分解為氨基酸、氨、三甲胺等堿性物質(zhì)，從而使魚肉pH值上升。與0 ℃相比，4 ℃下金槍魚pH值上升趨勢(shì)更為明顯，說明貯藏溫度較高會(huì)促進(jìn)蛋白質(zhì)加速分解，生成堿性物質(zhì)。王尊等[10]也發(fā)現(xiàn)冷藏過程中帶魚的pH值呈先下降后上升的相同趨勢(shì)。

2.2 冷藏期間金槍魚的aw、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

圖 2 金槍魚在0 ℃和4 ℃貯藏期間aw（A）和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）的變化Fig. 2 Changes in aw (A) and moisture content (B) of tuna during storage at 0 or 4 ℃

aw和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)是評(píng)價(jià)水產(chǎn)品保水性的重要指標(biāo)，并且能夠反映水產(chǎn)品的品質(zhì)、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味變化[19-20]。由圖2可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，aw和水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸降低，金槍魚的初始aw為0.990，貯藏第6天時(shí)0、4 ℃條件下分別下降到0.978、0.972（圖2A），主要因?yàn)樵谫A藏過程中，金槍魚肉受到微生物的侵染，肌肉組織結(jié)構(gòu)被破壞，造成大量的水分流失，導(dǎo)致魚肉品質(zhì)的劣化[21]。在0 ℃貯藏的第6天，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降至73.36%，而4 ℃貯藏條件下的第6天已下降至70.51%（圖2B），說明4 ℃條件下的下降趨勢(shì)更為明顯，貯藏溫度較高加速了水分的流失。

2.3 冷藏期間金槍魚的TBA值變化

圖 3 金槍魚在0 ℃和4 ℃貯藏期間TBA值的變化Fig. 3 Changes in TBA value of tuna during storage at 0 or 4 ℃

TBA值能反映水產(chǎn)品不飽和脂肪酸的氧化程度，測(cè)定原理是產(chǎn)生的丙二醛與硫代巴比妥酸反應(yīng)生成穩(wěn)定的紅色化合物[22]。如圖3所示，0 ℃和4 ℃條件下，TBA值總體呈明顯上升趨勢(shì)，這主要是因?yàn)橘A藏過程中魚肉發(fā)生自動(dòng)氧化和水解作用，產(chǎn)生的低級(jí)醛、酮類物質(zhì)會(huì)促使魚肉的品質(zhì)劣變[23]。0 ℃條件下金槍魚的TBA初始值為1.41 mg/100 g，貯藏結(jié)束時(shí)（6 d）上升至6.18 mg/100 g，而4 ℃條件下TBA值上升到6.48 mg/100 g，溫度高使魚肉更容易氧化。

2.4 冷藏期間金槍魚的水分遷移的情況

通過LF-NMR技術(shù)可分析金槍魚肉中水分的分布狀態(tài)、不同狀態(tài)水的含量以及水分遷移過程[24]。LF-NMR橫向弛豫時(shí)間T2能反映金槍魚內(nèi)部氫質(zhì)子所處的環(huán)境，與氫質(zhì)子所受的束縛力及其自由度有關(guān)。金槍魚在低溫貯藏過程中不同狀態(tài)水分的分布和水分遷移的情況見表1，LF-NMR圖中一共出現(xiàn)3 個(gè)組分峰，分別為T2b（強(qiáng)結(jié)合水）在0～1 ms之間，表示與金槍魚肉緊密結(jié)合的水，在貯藏期間變化趨勢(shì)不顯著。T21（不易移動(dòng)水）在4～100 ms之間，表示在金槍魚肉肌原纖維內(nèi)及間隙的水。隨著貯藏時(shí)間的延長，T21左移，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基被破壞，疏水性降低，部分空間結(jié)構(gòu)外的水開始被束縛。在貯藏后期，魚肉的微生物繁殖速度變快，疏松多孔結(jié)構(gòu)遭到破壞，造成空隙體積的縮小，引起不易流動(dòng)水的遷移，4 ℃條件下T21變化趨勢(shì)更明顯，說明貯藏溫度較高時(shí)，肌絲網(wǎng)收縮，肌原纖維內(nèi)部空間變小，存在于肌原纖維間隙的水分被擠出，不易流動(dòng)水流失，加速魚肉品質(zhì)劣變。T22（自由水）在40～600 ms之間，代表在肌原纖維外的水。冷藏前期，T22左移，原因可能是低溫使金槍魚肉中水分子自由度降低，束縛力較強(qiáng)，自由水與金槍魚肉蛋白質(zhì)的結(jié)合程度降低。在冷藏期間后期，微生物和酶類物質(zhì)作用使得肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到破壞，并且導(dǎo)致肌原纖維間隙的水向外流出，不易流動(dòng)水向自由水遷移，使得T22開始增大。

表 1 金槍魚在0 ℃和4 ℃橫向弛豫時(shí)間T2變化Table 1 Changes in transverse relaxation time T2 of tuna during storage at 0 or 4 ℃

圖 4 金槍魚在0 ℃和4 ℃貯藏期間核磁共振成像圖Fig. 4 Magnetic resonance images of tuna during storage at 0 or 4 ℃

通過MRI可直觀地觀察水分分布以及遷移情況[25]。圖4顯示金槍魚在低溫貯藏（0、4 ℃）的第0、3、6天的水分質(zhì)子密度偽彩圖，灰度范圍為0～250，不同顏色表示灰度的大小，灰度越大表示水分質(zhì)子密度越高，反之亦然[9,26]。根據(jù)金槍魚偽彩圖的顏色分布，能夠直觀觀察水分的分布。隨著貯藏時(shí)間的延長，紅色逐漸向藍(lán)色轉(zhuǎn)變，說明金槍魚水分質(zhì)子密度降低，水分含量逐漸減少。0 ℃貯藏組第3天偽彩圖有部分變成黃色，而4 ℃貯藏組第3天幾乎全變黃色，表明4 ℃組質(zhì)子密度更低，有部分水分流失。貯藏到第6天，顏色已有部分變藍(lán)，組織結(jié)構(gòu)被破壞，腐敗區(qū)域從內(nèi)部擴(kuò)散到表面。且4 ℃貯藏金槍魚水分含量和遷移變化程度比0 ℃的金槍魚更為明顯，說明較高溫度對(duì)會(huì)加速金槍魚品質(zhì)的劣變。

2.5 冷藏期間金槍魚的脂肪酸變化

水產(chǎn)品的脂肪酸含量和組成作為評(píng)價(jià)水產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值具有重要作用[27]。由表2可知，從金槍魚肉中共檢測(cè)出30 種脂肪酸，其中11 種為不飽和脂肪酸。在第0天不飽和脂肪酸DHA含量（892.486 2 μg/g）最高，EPA含量（103.991 2 μg/g）較高，EPA和DHA具有在防治心腦血管疾病、抗癌、抗炎癥等功效，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。隨著貯藏時(shí)間的延長，在0 ℃條件下DHA和EPA含量在貯藏末期（6 d）分別下降至250.675 8 μg/g和82.645 4 μg/g，且4 ℃條件下DHA和EPA含量下降得更多。而在0 ℃和4 ℃條件下飽和脂肪酸含量有所升高，其中C16:0含量升高尤為顯著。說明在冷藏過程中金槍魚肉脂肪酸發(fā)生降解現(xiàn)象，有部分不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成飽和脂肪酸，且溫度高加速脂肪酸的降解。脂肪酸降解會(huì)產(chǎn)生游離脂肪酸和氧化產(chǎn)物，其中氧化產(chǎn)物與蛋白質(zhì)反應(yīng)，影響魚肉的風(fēng)味以及質(zhì)構(gòu)，導(dǎo)致魚肉品質(zhì)及營養(yǎng)價(jià)值的降低[28]。

表 2 金槍魚在0 ℃和4 ℃的脂肪酸組成變化Table 2 Changes in fatty acid composition of tuna during storage at 0 or 4 ℃

2.6 相關(guān)性分析結(jié)果

表3是根據(jù)Pearson相關(guān)分析法得出的金槍魚在冷藏條件下T2與脂肪酸（含量較高的前6 種脂肪酸）含量之間的相關(guān)性。脂肪酸含量與T2呈現(xiàn)良好的相關(guān)性，T2b與C18:0、EPA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)合水以氫鍵的形式與脂肪酸、蛋白質(zhì)和多糖等結(jié)合[29]，貯藏時(shí)間和溫度會(huì)影響氫鍵與脂肪酸結(jié)合的能力，從而影響魚肉的品質(zhì)。T21與DHA含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），說明T21增大，DHA含量隨之增大。T22與C18:0、C18:1n9c含量分別呈極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）正相關(guān)。在冷藏過程中不易流動(dòng)水對(duì)DHA含量影響顯著，自由水對(duì)C18:0和C18:1n9c含量影響顯著。自由水可被用于微生物生長、酶促以及氧化反應(yīng)，進(jìn)而影響部分脂肪酸氧化代謝程度[24,30-31]。金槍魚在貯藏過程中T22逐漸增大，說明水分自由度逐漸增加，可促進(jìn)物質(zhì)代謝，加速部分不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為飽和脂肪酸。由于多不飽和脂肪酸分子中富含不飽和雙鍵，對(duì)溫度敏感，易被氧氣氧化降解，在水分和微生物的共同作用下發(fā)生氧化作用，以上結(jié)果說明T2與脂肪酸含量有良好的相關(guān)性，可以通過LF-NMR橫向弛豫時(shí)間T2表征部分脂肪酸的變化，實(shí)現(xiàn)快速評(píng)價(jià)金槍魚品質(zhì)變化。

表 3 金槍魚在冷藏期間水分遷移與脂肪酸各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation between water migration and fatty acids of tuna during cold storage

3 結(jié) 論

隨著貯藏時(shí)間的延長，pH值先降低后升高，TBA值逐漸升高，而水分含量和aw逐漸下降，金槍魚的品質(zhì)發(fā)生了劣變。LF-NMR橫向弛豫時(shí)間T2和核磁偽彩圖的結(jié)果表明，表征不易流動(dòng)水的T21左移，氫質(zhì)子的密度逐漸變小，表明在貯藏過程中肌原纖維內(nèi)的水流失，肌肉的保水性降低。在冷藏過程中金槍魚肉脂肪酸發(fā)生降解，部分不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化成飽和脂肪酸。T2b與C18:0、EPA含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），T21與DHA含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），T22與C18:0、C18:1n9c含量分別呈極顯著（P＜0.01）和顯著（P＜0.05）正相關(guān)。因此，可以通過LF-NMR技術(shù)檢測(cè)金槍魚肉水分遷移來評(píng)定金槍魚肉脂肪酸降解程度，從而快速無損監(jiān)測(cè)金槍魚在冷藏期間品質(zhì)變化，為水產(chǎn)品快速檢測(cè)提供了理論依據(jù)。