郭增旺，樊乃境，田海芝，滕 飛，李 萌，李 楊，王中江,，江連洲,2,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司，山東 禹城 253000）

機體生長代謝過程中產(chǎn)生的自由基具有多種生理功能，如預防感染、激活細胞活性、傳導信號等。但是過多的自由基能導致機體正常的細胞組織發(fā)生病變并引起氧化應激反應[1-2]，并促進癌癥、動脈粥樣硬化和糖尿病等疾病的病理學發(fā)展[3-5]。因此，當機體受到外源性氧化物質(zhì)攻擊或內(nèi)源性氧化損傷時，體內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡就會遭到破壞，從而會引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）在體內(nèi)堆積并產(chǎn)生細胞毒性作用[5-6]。自由基會氧化細胞膜、代謝酶系、蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)，還會誘導細胞凋亡，對機體的細胞及器官造成損傷[7-8]。大量研究表明，通過膳食補充抗氧化成分能夠調(diào)節(jié)機體內(nèi)的自由基水平[9-11]和增強機體的防御能力，進而幫助維持機體的氧化動態(tài)平衡[12-16]。因此，開發(fā)具有清除自由基功能的食品和藥物日益受到重視。

小米糠是谷子經(jīng)過加工后的農(nóng)副產(chǎn)物，占小米總質(zhì)量的6%～8%。目前，我國小米年產(chǎn)量可達500萬 t，加工小米將產(chǎn)生小米糠近40萬 t，因此小米糠為一種產(chǎn)量較大的農(nóng)副利用資源[17]。目前，小米糠主要被當作動物飼料進行處理，造成了巨大的資源浪費。小米糠富含蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素和維生素等，可以作為一種功能性的食品加工原料。Shan Shuhua等[18]從小米糠中提取得到一種新型FMBP蛋白，具有靶向抗結(jié)腸癌的作用。Bijalwan等[19]從小米糠中提取得到一種HCA-AXs功能性糖，具有較高的抗氧化活性。Balakrishnan等[20]將小米糠進行乳酸菌發(fā)酵制備乳酸，證實了小米糠可作為良好的乳酸加工原料進行工業(yè)化生產(chǎn)。研究表明，黃酮類化合物具有極佳的生理藥理保健功能，具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老、緩解炎性生物酶滲出，加速傷口愈合和止痛等功效[21]，在食品、保健品、醫(yī)藥等各領(lǐng)域均有極其廣闊的應用價值[22-23]。而小米糠中黃酮含量極為豐富，本課題組前期提取小米糠黃酮（flavonoids from millet bran，F(xiàn)MB）并通過體外實驗評價了其抗炎活性，結(jié)果表明超聲微波協(xié)同萃取得到的FMB具有體外抗炎活性[24]。但是關(guān)于FMB的抗氧化活性及其作用機制尚未明確。

為了系統(tǒng)準確地評價小米糠的抗氧化生物活性及其作用機制，本實驗采用H2O2誘導HepG2細胞構(gòu)建細胞氧化應激損傷模型，采用CCK-8檢測細胞存活率，流式細胞儀檢測胞內(nèi)ROS水平，酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測胞內(nèi)抗氧化酶系活性，Western blotting法檢測細胞凋亡通路蛋白表達量，以此評價FMB的抗氧化活性并探索其作用機理，從而為小米糠的功能性食品開發(fā)和抗氧化藥物的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米糠 河北冀州市盈潤商貿(mào)有限公司。

FMB為實驗室通過超聲微波協(xié)同輔助萃取制得[24]，純度82.8%；人肝癌細胞HepG2 哈爾濱醫(yī)科大學；DMEM高糖液體培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素 美國Hyclone公司；胎牛血清 浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶消化液 美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（增強型）、RIPA細胞裂解液、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT） 碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗bax、p53、Caspase-3單克隆抗體、鼠抗Caspase-3單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗、辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗 美國CST公司。

1.2 儀器與設備

CO2細胞培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher公司；多功能酶標儀 中國臺北Welgene公司；FACS Calibur流式細胞儀 美國BD公司；EVOS熒光顯微鏡 美國Life Technologies公司；半干轉(zhuǎn)膜儀、電泳槽、ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；TS-2000A多用脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FMB的制備

參照課題組前期研究的方法[24]，采用超聲微波協(xié)同輔助萃取法提取FMB，具體工藝參數(shù)為超聲微波時間0.87 h、乙醇體積分數(shù)77%、料液比1∶19和微波功率486 W。

1.3.2 細胞培養(yǎng)與分組

將HepG2細胞置于含有10%的胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM（高糖）培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞數(shù)量達到80%～90%后，吸去培養(yǎng)液，用PBS沖洗一次，加入1 mL胰蛋白酶消化3 min，進行傳代培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的細胞接種于培養(yǎng)板中培育4 h后，更換培養(yǎng)基除去未貼壁細胞，并對其進行分組[23]。正常對照組：不加FMB和H2O2干預處理，只加入等量的PBS溶液；氧化應激模型組：不加FMB干預，加入等量的PBS溶液培養(yǎng)24 h后，加入終濃度為2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h；實驗組：FMB低、中、高劑量組（FMB-L、FMB-M、FMB-H，終質(zhì)量濃度分別為50、100、150 μg/mL）干預24 h后，加入終濃度為2 mmol/L H2O2溶液刺激1 h。

1.3.3 FMB對H2O2誘導HepG2細胞的存活率的測定

參照臧琳等[25]的方法，并略加改動。采用CCK-8法，按試劑盒說明書測定各組吸光度，細胞存活率按下式計算。

1.3.4 FMB對H2O2誘導HepG2細胞的胞內(nèi)ROS水平的測定

參考Wang Wei等[26]的方法，并略加改動。選取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0×105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細胞后，每孔加入終濃度10 μmol/L的DCFH-DA熒光探針，37 ℃避光反應20 min后吸去探針，用預冷的PBS洗滌細胞2 次，隨后采用胰酶消化液消化細胞，離心除去上清液，PBS重懸細胞，并采用流式細胞儀測定活細胞的ROS相對強度。

1.3.5 FMB對H2O2誘導HepG2細胞的MDA水平的測定

參考劉艷等[27]的方法，并略加改動。選取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0×105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細胞后，每孔加入100 μL細胞裂解液使細胞裂解，于4 ℃、1 600×g離心10 min，取上清液作為樣本，參照試劑盒說明書對細胞內(nèi)的MDA水平進行測定，單位為nmol/mL。

1.3.6 FMB對H2O2誘導HepG2細胞的胞內(nèi)抗氧化酶系活力的測定

參照臧琳等[25]的方法，并略加改動。選取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0×105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細胞后，用預冷PBS洗滌1 次，洗除PBS，刮下細胞轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，離心棄上清液，加入細胞裂解液，4 ℃、12 000×g離心10 min。取上清液按照試劑盒說明書操作檢測SOD、GSH-Px及CAT活力，余下部分采用BCA法進行蛋白質(zhì)量濃度測定。

1.3.7 FMB對H2O2誘導HepG2細胞的胞內(nèi)蛋白表達量的測定

參照Han等[28]的方法，并略加改動。選取對數(shù)生長期的HepG2細胞接種于6 孔板內(nèi)，每孔體積2 mL，接種密度為1.0×105個/mL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按照1.3.2節(jié)分組方法處理細胞后，加入100 μL RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白質(zhì)量濃度測定，配制質(zhì)量分數(shù)10%的分離膠和5%的濃縮膠，上樣，恒壓50、80、120 V電泳各30 min，半干法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，暗室中加發(fā)光染料底物混合物1 mL于膜上顯色1 min，曝光顯影，結(jié)果采用Image Lab軟件進行定量分析處理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，用方差分析進行顯著性檢驗，組間比較采用Tukey法來進行。實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 FMB對H2O2誘導HepG2細胞存活率的影響

細胞存活率是反映外界環(huán)境對細胞損傷程度的最直觀指標。氧化應激的環(huán)境能導致胞內(nèi)活性氧水平的升高，對HepG2細胞造成氧化損傷進而誘導細胞凋亡[29]，其存活率的下降是氧化應激模型建立成功的標志之一。H2O2是一種重要的活性氧分子，性質(zhì)相對穩(wěn)定，常作為體外氧化應激損傷的造模藥物，超氧陰離子自由基能使細胞膜上的脂質(zhì)物質(zhì)和蛋白發(fā)生氧化反應，還能與胞內(nèi)的鐵離子反應生成·OH等自由基，造成細胞氧化應激狀態(tài)和組織損傷[28]。

圖 1 FMB對H2O2誘導HepG2細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of FMB on viability of HepG2 cells with damage induced by H2O2

由圖1可知，與正常組相比，H2O2構(gòu)建的氧化應激模型組的細胞存活率顯著下降（P＜0.05），這表明氧化應激模型構(gòu)建成功；與模型組相比，F(xiàn)MB中、高劑量組能顯著提升細胞存活率（P＜0.05），且呈現(xiàn)量效關(guān)系。這表明FMB對HepG2具有一定程度的保護作用，能緩解H2O2對HepG2的氧化應激損傷。

2.2 FMB對H2O2誘導HepG2胞內(nèi)ROS含量的影響

ROS是細胞氧化系統(tǒng)中產(chǎn)生的含有ROS功能基團的化合物。正常細胞內(nèi)的ROS的生成和清除處于動態(tài)平衡，適當?shù)腞OS可以促進機體巨噬細胞發(fā)揮其吞噬和酶解的免疫生理功能[30-31]。但是在外界刺激時，胞內(nèi)清除ROS的調(diào)控作用機制失調(diào)，過多的ROS將會對細胞的細胞膜、蛋白質(zhì)和核酸造成氧化損傷進而導致細胞凋亡[32]。

圖 2 FMB對H2O2誘導HepG2胞內(nèi)ROS水平的影響Fig. 2 FMB suppressed H2O2-induced ROS generation in HepG2 cells

由圖2可知，與正常組相比，H2O2構(gòu)建的氧化應激模型組的胞內(nèi)ROS水平顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)MB-L、FMB-M、FMB-H組均能顯著提升細胞存活率（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。這表明FMB能顯著緩解H2O2所引起HepG2胞內(nèi)ROS水平的升高，抑制ROS對細胞膜和胞內(nèi)物質(zhì)的氧化損傷，進而發(fā)揮抗氧化應激功能。

2.3 FMB對H2O2誘導HepG2的MDA水平的影響

機體存在天然的氧化調(diào)控系統(tǒng)，自身的抗氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)能抵抗一定程度的外界氧化應激刺激，避免外界對機體造成的損傷[33]。但是當氧化應激程度較為強烈并且機體的抗氧化系統(tǒng)不足以彌補調(diào)控時，首先會引起細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應，而MDA則是細胞膜被氧化后所生成的重要代謝產(chǎn)物，因此，MDA水平直接反映了細胞膜受到自由基氧化損傷程度[34]。

圖 3 FMB對H2O2誘導HepG2細胞MDA濃度的影響Fig. 3 Effect of FMB on MDA content in HepG2 cells induced by H2O2

由圖3可知，與正常組相比，H2O2構(gòu)建的氧化應激模型組的胞內(nèi)MDA濃度顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)MB-L、FMB-M、FMB-H組能顯著降低胞內(nèi)MDA濃度（P＜0.05），且呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。這表明HepG2細胞經(jīng)H2O2誘導后細胞膜發(fā)生嚴重損傷，而FMB能顯著緩解活性氧對細胞膜脂質(zhì)氧化損傷的影響，能減輕自由基對機體的氧化應激損傷。

2.4 FMB對H2O2誘導HepG2抗氧化物酶系活力的影響

機體自身存在酶抗氧化系統(tǒng)和非酶抗氧化系統(tǒng)抵御外界氧化應激刺激原[25]。SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化酶系的重要組成部分。SOD、CAT是抵御氧化應激刺激的第一道防線，GSH-Px是機體內(nèi)重要的過氧化物分解酶，能催化GSH和過氧化物還原成無毒的羥基化合物和氧化型谷胱甘肽，從而避免機體遭受過氧化物的損傷。機體的抗氧化物酶系在發(fā)揮抗氧化和維持氧化應激動態(tài)平衡中發(fā)揮了重要作用，其酶系活力直接反映出機體對外界氧化應激原的平衡調(diào)控水平[35-36]。

圖 4 FMB對H2O2誘導HepG2細胞SOD（A）、CAT（B）、GSH-Px（C）活力的影響Fig. 4 Effect of FMB on SOD (A), CAT (B) and GSH-Px (C) activity in HepG2 cells induced by H2O2

由圖4可知，與正常組相比，H2O2構(gòu)建的氧化應激模型組的抗氧化物酶系活力顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)MB-L組的CAT活力顯著升高，F(xiàn)MB-M和FMB-H組的SOD、CAT、GSH-Px活力顯著升高。這表明該濃度下的H2O2能破壞細胞的氧化調(diào)節(jié)系統(tǒng)，降低胞內(nèi)抗氧化酶系的活力，致使胞內(nèi)的氧化動態(tài)平衡失衡和胞內(nèi)MDA水平上升，導致細胞發(fā)生不可逆的氧化損傷；同時也表明氧化應激模型構(gòu)建成功；而FMB預培養(yǎng)后能緩解H2O2造成的胞內(nèi)抗氧化物酶系活力降低并且降低胞內(nèi)MDA水平，對氧化應激損傷有保護作用，能提高機體對外界氧化應激的調(diào)控能力。這也和之前FMB能緩解H2O2所引起的細胞存活率降低和ROS水平上升的結(jié)果相一致。

2.5 FMB對H2O2誘導HepG2的凋亡信號通路影響

Caspases通路是所有細胞發(fā)生凋亡時都會被激活的通路，而Caspase-3是細胞發(fā)生凋亡的最終執(zhí)行者，被激活后轉(zhuǎn)化為能誘導凋亡的活性片段進入核內(nèi)激活磷酸內(nèi)切酶，進而使DNA裂解導致細胞凋亡[37]。而bax和p53是Caspase-3的上游蛋白，其中bax能調(diào)控線粒體凋亡通路，當bax被激活時能誘導線粒體凋亡通路的發(fā)生進而激活Caspase-3蛋白；p53主要介導DNA損傷后的細胞應激反應，可直接激活Caspase-3蛋白誘發(fā)細胞凋亡[38]。

圖 5 FMB對H2O2誘導HepG2的bax、p53、Caspase-3蛋白表達量的影響Fig. 5 Effect of FMB on expression of p53 and caspase-3 in HepG2 cells induced by H2O2

由圖5可知，與正常組相比，H2O2構(gòu)建的氧化應激模型組的bax、p53和Caspase-3蛋白的表達量均顯著上升（P＜0.05）；與模型組相比，F(xiàn)MB-L組的p53和Caspase-3蛋白表達量顯著下降（P＜0.05），F(xiàn)MB-M和FMB-H組的bax、p53和Caspase-3蛋白顯著下降（P＜0.05）。結(jié)合前面實驗結(jié)果可知，該濃度下的H2O2能使細胞存活率降低，并且使胞內(nèi)凋亡蛋白bax、p53和Caspase-3表達量顯著升高。bax凋亡蛋白的水平上升表示細胞的線粒體凋亡通路被激活，線粒體遭受到氧化應激損傷；p53凋亡蛋白的表達量上升代表DNA發(fā)生損傷后，細胞進行自我基因修復，當損傷不可修復時則激活Caspase-3凋亡蛋白的表達，而Caspase-3蛋白是細胞發(fā)生凋亡的最終執(zhí)行者。這表明H2O2能激活細胞線粒體凋亡通路和Caspase-3凋亡通路，進而導致細胞存活率下降。而FMB能顯著緩解H2O2所引起的HepG2胞內(nèi)凋亡通路蛋白表達量的升高，表明FMB能通過協(xié)助細胞抵御氧化應激對線粒體和胞內(nèi)DNA的傷害，緩解細胞的氧化應激損傷和提高機體氧化應激的調(diào)控能力。

當HepG2受到外界氧化應激原刺激后，會引起胞內(nèi)活性氧水平的升高，使細胞膜脂質(zhì)發(fā)生氧化反應并生成代謝產(chǎn)物MDA，胞內(nèi)MDA水平的升高。為了抵御外界氧化應激原的刺激和維持細胞正常生存環(huán)境，機體的抗氧化物酶系會發(fā)揮調(diào)控功能，但當刺激程度過高時，抗氧化系統(tǒng)不足以補償外界刺激，就會導致大量抗氧化物酶系酶活力降低和消耗，氧化動態(tài)平衡被破壞，導致膜通透性增強，并且對線粒體和胞內(nèi)遺傳物質(zhì)DNA造成損傷，引起線粒體凋亡通路中bax蛋白和Caspase凋亡通路的p53蛋白、Caspase-3凋亡蛋白表達量升高，誘導其凋亡。而本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)MB能顯著提高HepG2的存活率、降低MDA和胞內(nèi)ROS水平、緩解H2O2所引起抗氧化物酶活力的降低和下調(diào)凋亡蛋白的表達。這和藺曼[39]、劉國艷[40]和鄭瑞芳[41]等的結(jié)果一致，但是不同物質(zhì)提取的黃酮對各指標的響應值和抗氧化應激能力是不同的。這說明黃酮類化合物對氧化應激的調(diào)控能力和自身組成成分及含量有關(guān)，不同原料中存在多種黃酮單體組分，相互之間可能發(fā)揮協(xié)同或者是拮抗的作用。目前關(guān)于黃酮的氧化應激調(diào)控機制研究多集中在ERK和核因子κB等炎癥通路[42]，從線粒體凋亡通路和Caspase凋亡通路進行探究作用機制的研究還較少，仍需進一步深入研究。這表明，F(xiàn)MB能通過降低胞內(nèi)ROS水平、提高過氧化酶系、增強細胞線粒體及DNA對外界氧化應激的抵御能力和抑制凋亡通路的激活進行增強機體對外界氧化應激的調(diào)控能力。

3 結(jié) 論

實驗以FMB為研究對象，以H2O2誘導HepG2細胞構(gòu)建氧化應激損傷模型，分別從細胞存活率、胞內(nèi)ROS水平、MDA水平、抗氧化酶系活力和凋亡蛋白表達量探討FMB對氧化應激損傷的修復作用。結(jié)果表明：FMB能顯著緩解H2O2引起的HepG2細胞存活率的降低和胞內(nèi)ROS、MDA水平的升高，恢復抗氧化酶系酶活力和下調(diào)bax、p53和Caspase-3凋亡蛋白的表達量。這表明FMB能通過抑制細胞凋亡通路蛋白的表達，調(diào)控細胞的氧化還原系統(tǒng)、清除胞內(nèi)活性氧、提高胞內(nèi)抗氧化酶系的活性，緩解氧化應激對機體所造成的損傷，增強機體對外界氧化應激的調(diào)控能力。