鄭夢菲，劉 健，屈 瑋

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

巨噬細(xì)胞是機(jī)體最重要的免疫細(xì)胞之一，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，而炎癥又與代謝性疾病的發(fā)生與發(fā)展息息相關(guān)[1-3]。在不同的微環(huán)境影響下，巨噬細(xì)胞可以極化為不同的亞型，發(fā)揮不同的作用[4]。在體外培養(yǎng)條件下，不同的刺激方式也可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向不同方向極化。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞，也稱作M1型巨噬細(xì)胞[5]。LPS通過與細(xì)胞膜表面Toll樣受體4結(jié)合，進(jìn)而激活炎癥信號通路，促進(jìn)細(xì)胞高表達(dá)表面抗原分化簇（cluster of differentiation，CD）274、CD38、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），并且分泌多種促炎性因子，如白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein 1，MCP1）等[6-8]。

黃酮類化合物泛指由2 個苯環(huán)（A環(huán)與B環(huán)）通過中間三碳原子相連而成的一系列化合物（圖1），水果、蔬菜以及茶、紅酒等植物來源的飲品是人體攝取黃酮類化合物的主要食物來源[9-10]。黃酮類化合物根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可分類為黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、異黃酮類等亞型[11]。有研究報道，目前發(fā)現(xiàn)數(shù)目最多且最常見的天然黃酮主要是黃酮類和黃酮醇類，木犀草素、芹菜素、白楊素和槲皮素、楊梅素、山柰酚是食物中最常見的黃酮類和黃酮醇類化合物[9,12]。另一方面，這6 種黃酮類化合物還都具有5,7-二羥基黃酮的結(jié)構(gòu)特征，如圖1所示，它們的結(jié)構(gòu)差異僅在于C環(huán)3位有無羥基取代和B環(huán)上的羥基取代數(shù)目不同。

圖 1 6 種黃酮的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of six flavonoids

本研究以LPS刺激RAW264.7細(xì)胞建立炎癥模型，考察木犀草素、芹菜素、白楊素、槲皮素、楊梅素及山柰酚這6 種最為常見的食物源黃酮抑制巨噬細(xì)胞向M1極化的活性強弱，并探究其抗炎活性與結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系，為黃酮化合物抗炎的構(gòu)效關(guān)系研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

木犀草素（純度≥98%，生產(chǎn)批號Lot.RQ3018R205） 上海華壹生物科技有限公司；芹菜素（純度≥98%） 南京春秋生物工程有限公司；槲皮素（純度≥95%，生產(chǎn)批號Lot. SLBH4526V）、楊梅素（純度≥99%，生產(chǎn)批號Lot. BCBS7165V）、山柰酚（純度≥97%，生產(chǎn)批號Lot. BCBS9762V）、白楊素（純度≥97%，生產(chǎn)批號Lot. STBF6934V）（均為色譜純）及二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）、LPS、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；APC標(biāo)記鼠抗CD274、PE標(biāo)記鼠抗CD38美國BioLegend公司；β-actin抗體、核因子κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa-B，IκB）α抗體、pIκBα抗體、二抗 美國Cell Signaling Technology公司；TRIzol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Mix 日本TaKaRa公司；異丙醇、氯化鈉等其他試劑（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHJH-C超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司；Forma Series II Water Jacket細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀 美國Thermo Scientific公司；MoFlo XDP流式細(xì)胞儀 美國Beckman Coulter公司；Mini-PROTEAN Tetra Western blot電泳轉(zhuǎn)膜儀、IQ2熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；ImageQuantLAS 400 mini熒光成像系統(tǒng) 瑞典GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，將RAW264.7細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞活性

(3)良好的前期旅游基礎(chǔ)優(yōu)勢。主題文化游、鄉(xiāng)村休閑游、農(nóng)耕體驗游、現(xiàn)代工業(yè)游等旅游業(yè)態(tài)基本形成，豐富了旅游內(nèi)涵，為大力發(fā)展全域旅游打下了堅實的基礎(chǔ)。長沙市望城區(qū)將旅游景點與體育賽事結(jié)合，已舉行千龍湖國際龍舟賽、黑麋峰世界自行車速降賽、環(huán)法自行車中國賽等具有國際影響力的體育賽事。寧鄉(xiāng)市統(tǒng)籌規(guī)劃美麗鄉(xiāng)村建設(shè)，已打造關(guān)山古鎮(zhèn)、湘都農(nóng)業(yè)生態(tài)園、豐收灣、稻花香農(nóng)趣園、石侖關(guān)等特色鄉(xiāng)村旅游產(chǎn)品，而且寧鄉(xiāng)的灰湯已于2016年獲批全國首批“國家康養(yǎng)旅游示范基地”。長沙縣的開慧鎮(zhèn)則結(jié)合“楊開慧故居”和“瓜果采摘體驗游”，形成了“紅色旅游+綠色旅游”的特色旅游路線。

將RAW264.7細(xì)胞接入96 孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制），培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液繼續(xù)孵育4 h。吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm波長處測定各孔的光密度值。以不接種細(xì)胞的等體積DMEM高糖培養(yǎng)基為空白組，以加入與黃酮溶液等體積的DMSO為對照組。細(xì)胞存活率按下式計算。

1.3.3 流式細(xì)胞分析

將RAW264.7細(xì)胞接入12 孔板中，待細(xì)胞長至約80%融合時，同時加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制）和終質(zhì)量濃度為100 ng/mL的LPS處理24 h，以添加等體積DMSO為對照，處理結(jié)束后吸去上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）清洗1 遍，每孔加入1 mL含體積分?jǐn)?shù)5% FBS的PBS，用移液槍吹打細(xì)胞使其脫落，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中，4 ℃、400×g離心4 min，棄去900 μL上清液，加入封閉液后重懸，于冰上搖床封閉20 min，再在避光條件下加入CD274和CD38熒光抗體，于冰上搖床避光標(biāo)記40 min。標(biāo)記結(jié)束后加入400 μL含5% FBS的PBS，吹勻細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測。APC通道接收CD274熒光信號，PE通道接收CD38熒光信號，用流式細(xì)胞分析軟件FlowJo處理得到不同信號通道的抗體平均熒光強度。

1.3.4 總蛋白質(zhì)提取及Western blot檢測

將RAW264.7細(xì)胞接入24 孔板中，待細(xì)胞長至約80%融合時，加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制）或等體積DMSO處理12 h，再加入終質(zhì)量濃度為100 ng/mL的LPS處理30 min后，立即吸去上清液，用PBS清洗1 遍，每孔加入300 μL含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RTPA裂解液，用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1.5 mL的離心管中。充分裂解后，4 ℃、12 000×g離心30 min，收集上清液并轉(zhuǎn)移至新的離心管中，再加入上清液體積1/4的5×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上樣緩沖液，于100 ℃煮沸10 min，等體積等蛋白質(zhì)量上樣，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST溶液中室溫封閉2 h。封閉結(jié)束后，將膜轉(zhuǎn)移至一抗（1∶2 000，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白的TBST稀釋）中，4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3 次，每次10 min，然后轉(zhuǎn)移至二抗（1∶5 000，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白的TBST稀釋）中，室溫孵育2 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，放入熒光成像系統(tǒng)曝光拍照。利用圖像處理軟件ImageJ進(jìn)行灰度分析，pIκB/IκB表達(dá)量以pIκB條帶與IκB條帶灰度的比值表示。

1.3.5 總RNA提取及定量PCR分析

將RAW264.7細(xì)胞接入24 孔板中，待細(xì)胞長至約80%融合時，先加入終濃度20 μmol/L的6 種黃酮溶液（DMSO配制）或等體積的DMSO處理12 h，再加入終質(zhì)量濃度為100 ng/mL的LPS處理4 h，處理結(jié)束后吸去上清液，用PBS清洗1 遍，利用TRIzol試劑提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟合成cDNA。建立20 μL定量PCR反應(yīng)體系：10 μL SYBR Green Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、8.2 μL雙蒸水和1 μL cDNA?；靹蝮w系，5 000×g離心3 min后進(jìn)行定量PCR分析。采用ΔΔCt閾值循環(huán)法，以β-actin為內(nèi)參計算樣本間基因表達(dá)水平的相對差異。定量PCR引物序列詳見表1。

表 1 定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

實驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種黃酮對巨噬細(xì)胞活性的影響

圖 2 6 種黃酮對RAW264.7細(xì)胞活性的影響Fig. 2 Effect of six flavonoids on the viability of RAW264.7 cells

由圖2可知，與對照組相比，20 μmol/L的6 種黃酮溶液處理對RAW264.7細(xì)胞活性均無顯著影響，說明這6 種黃酮化合物在20 μmol/L條件下不影響巨噬細(xì)胞的正常生長。因此后續(xù)實驗采用20 μmol/L的木犀草素、槲皮素、楊梅素、芹菜素、山柰酚及白楊素處理經(jīng)100 ng/mL LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型，并比較它們的抗炎活性。

2.2 6 種黃酮對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白的影響

圖 3 6 種黃酮對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白表達(dá)的影響Fig. 3 Effect of six flavonoids on the expression of LPS-induced macrophage markers CD274 and CD38

由于RAW264.7細(xì)胞從接受LPS刺激到表面抗原CD的轉(zhuǎn)錄翻譯需要較長的時間，因此，選擇在LPS處理24 h后檢測RAW264.7細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)情況。如圖3所示，LPS處理極顯著增強了CD274和CD38抗體的平均熒光強度，而在LPS刺激同時分別添加6 種黃酮化合物處理，對LPS引起的CD274和CD38抗體熒光強度的增加均具有不同程度的抑制效果。其中，添加木犀草素、芹菜素或白楊素對LPS誘導(dǎo)的M1巨噬細(xì)胞CD274和CD38表達(dá)的抑制作用較強（P＜0.01）；槲皮素對CD274和CD38表達(dá)也有一定程度的抑制效果（P＜0.05，P＜0.01）。以上結(jié)果表明，木犀草素、芹菜素和白楊素3 種黃酮類化合物抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白表達(dá)的活性強于槲皮素、楊梅素和山柰酚這3 種黃酮醇類化合物，說明在其他位點的取代情況相同時，C環(huán)上3位的羥基取代可能不利于黃酮類化合物的活性。

2.3 6 種黃酮對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IκB磷酸化的影響

核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號通路對調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化及炎癥反應(yīng)的發(fā)生都發(fā)揮著重要作用[24-25]。在靜息狀態(tài)的巨噬細(xì)胞中，NF-κB與IκB結(jié)合而滯留在細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)LPS與巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合，觸發(fā)胞內(nèi)級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，能夠激活I(lǐng)κB激酶（IκB kinase，IKK），活化的IKK促使IκB發(fā)生磷酸化而被降解，進(jìn)而導(dǎo)致NF-κB解除抑制并轉(zhuǎn)位入核，與相關(guān)基因啟動子上NF-κB的結(jié)合序列結(jié)合，從而啟動基因轉(zhuǎn)錄[26-27]。為探討6 種膳食黃酮對NF-κB信號通路活化的影響，通過Western blot檢測巨噬細(xì)胞中IκB總蛋白及其磷酸化蛋白pIκB的表達(dá)水平。如圖4所示，LPS處理30 min時極顯著上調(diào)了IκB的磷酸化水平，導(dǎo)致IκB水平降低；在LPS刺激前，用木犀草素、槲皮素或芹菜素預(yù)處理12 h能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的IκB磷酸化水平的上調(diào)，抑制IκB降解，即降低pIκB/IκB表達(dá)量，說明木犀草素、槲皮素和芹菜素可以抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NF-κB信號通路的激活，其中木犀草素的抑制效果最明顯；而用楊梅素、山柰酚或白楊素預(yù)處理的巨噬細(xì)胞中pIκB/IκB表達(dá)量有所降低，但與LPS組差異不顯著。綜上說明木犀草素、槲皮素和芹菜素可以有效抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB信號通路的激活。

圖 4 6 種黃酮對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中IκB磷酸化的影響Fig. 4 Effect of six flavonoids on LPS-induced IκB phosphorylation

2.4 6 種黃酮對LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)水平的影響

圖 5 6 種黃酮對LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of six flavonoids on the expression of M1-type macrophage marker genes

經(jīng)LPS刺激后，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記基因iNOS mRNA相對表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。在LPS刺激前用木犀草素、芹菜素或白楊素預(yù)處理12 h，可以極顯著降低LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA表達(dá)水平的升高（P＜0.01），此外槲皮素、楊梅素和山柰酚預(yù)處理也有一定程度的改善作用（P＜0.05）（圖5A）。木犀草素、槲皮素或芹菜素預(yù)處理均極顯著抑制了LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞促炎性因子IL-1β和MCP1 mRNA相對表達(dá)水平的升高（P＜0.01），白楊素預(yù)處理使IL-1β和MCP1 mRNA相對表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），其抑制作用不如木犀草素、槲皮素和芹菜素明顯；楊梅素也在一定程度上抑制了IL-1β和MCP1的mRNA相對表達(dá)水平（圖5B、C）。結(jié)果表明，木犀草素、槲皮素和芹菜素對炎性基因IL-1β和MCP1 mRNA表達(dá)的抑制活性顯著強于楊梅素、山柰酚和白楊素，這一結(jié)果與上述6 種黃酮抑制IκB磷酸化的活性強弱趨勢基本一致，這可能是因為NF-κB信號通路參與調(diào)控炎性基因IL-1β和MCP1的轉(zhuǎn)錄[28]。另外，木犀草素、芹菜素和白楊素對M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物iNOS表達(dá)的抑制活性強于槲皮素、楊梅素和山柰酚，這與上述6 種黃酮抑制CD274和CD38表達(dá)的活性強弱趨勢一致，進(jìn)一步說明了木犀草素、芹菜素和白楊素這3 種黃酮類化合物對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化的抑制活性強于另外3 種黃酮醇類化合物（槲皮素、楊梅素和山柰酚），表明C環(huán)上3位的羥基取代可能不利于黃酮類化合物抑制巨噬細(xì)胞的M1極化。

3 討 論

目前，對黃酮類化合物抗炎活性的研究大多通過檢測炎性信號通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及炎性因子的水平。本實驗考察了NF-κB信號途徑中關(guān)鍵蛋白IκB的磷酸化水平及促炎性因子iNOS、IL-1β和MCP1 mRNA相對表達(dá)水平。結(jié)果表明，6 種黃酮在抑制IκB磷酸化和IL-1β及MCP1 mRNA相對表達(dá)水平這兩方面的活性強弱趨勢一致，木犀草素、槲皮素和芹菜素能夠有效抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB信號通路的活化，山柰酚和白楊素對IκB磷酸化沒有顯著抑制作用，這與之前研究結(jié)果[21,27,29]一致，而楊梅素對IκB磷酸化的影響目前鮮見報道。

NF-κB信號通路激活所調(diào)控的核內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄以及PCR檢測結(jié)果都只反映了其在巨噬細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平，不足以證明巨噬細(xì)胞的最終極化狀態(tài)。表面抗原CD是細(xì)胞分化不同階段及活化過程中出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白，為不同類型或分化階段細(xì)胞所特有，其表達(dá)水平反映了細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)[30]，因此，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD可以更精確地定義細(xì)胞類型。M1型巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)CD274、CD38，而M2型巨噬細(xì)胞表面高表達(dá)CD206、CD301，所以根據(jù)表面標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平可區(qū)分M1和M2型巨噬細(xì)胞[31-32]。本實驗通過流式細(xì)胞術(shù)分析了6 種黃酮對巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白CD274和CD38表達(dá)的影響，結(jié)果表明，木犀草素、芹菜素和白楊素抑制LPS誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞CD274或CD38表達(dá)的活性均強于槲皮素、楊梅素和山柰酚，這與木犀草素、芹菜素和白楊素對M1型巨噬細(xì)胞另一標(biāo)記物iNOS的mRNA相對表達(dá)抑制作用結(jié)果一致。綜合上述結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，木犀草素抑制巨噬細(xì)胞向M1型極化的活性較槲皮素強，芹菜素的抑制活性也較山柰酚強。分析6 種5,7-二羥基黃酮的結(jié)構(gòu)特征（圖1）發(fā)現(xiàn)，木犀草素和槲皮素、芹菜素和山柰酚在B環(huán)上的羥基取代數(shù)目和位置相同，而槲皮素較木犀草素在C環(huán)3位多出一個羥取代基；芹菜素和山柰酚的結(jié)構(gòu)差異與此相同，推測當(dāng)B環(huán)的羥基取代情況相同時，C環(huán)上3位的羥基取代不利于黃酮類化合物抑制巨噬細(xì)胞的M1極化。

進(jìn)一步分析，當(dāng)C環(huán)的羥基取代情況相同時，B環(huán)上的羥基取代對黃酮化合物抑制巨噬細(xì)胞M1極化的影響，本實驗通過測定發(fā)現(xiàn)，3 種黃酮類化合物對IκB磷酸化水平的抑制活性為木犀草素＞芹菜素＞白楊素，對炎性因子IL-1β、MCP1 mRNA表達(dá)水平的抑制活性為木犀草素/芹菜素＞白楊素。根據(jù)三者的結(jié)構(gòu)（圖1）可知，與木犀草素相比，芹菜素缺少3’位的羥基取代，白楊素缺少3’、4’位的羥基取代，這說明3’、4’位的羥基有利于增強黃酮類化合物抑制巨噬細(xì)胞炎性的活性。在3 種黃酮醇類化合物中，與槲皮素相比，山柰酚缺少3’位的羥基取代，其活性遠(yuǎn)低于槲皮素，也同樣說明3’、4’位羥取代基的重要作用。

天然黃酮化合物的活性作用取決于其結(jié)構(gòu)類型、羥基化程度及其他官能團(tuán)的取代情況[33]。因此，針對黃酮類化合物的生物活性進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系的探討尤為重要。本實驗對6 種5,7-二羥基黃酮抑制巨噬細(xì)胞M1極化的活性與其結(jié)構(gòu)特征的關(guān)系進(jìn)行了總結(jié)，以期為食物源黃酮化合物的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供思路。