李芳芳，叢 賀，沈明花

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

酒精作為各種酒類(lèi)飲品的主要成分，與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。長(zhǎng)期大量飲酒可引起血壓的升高[1-2]、脂質(zhì)代謝的紊亂及心肌細(xì)胞的損傷，從而增加罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)和心血管疾病意外的發(fā)生[3-6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管系統(tǒng)的重要組成部分，在心血管疾病的病理生理過(guò)程中起至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅起到機(jī)械屏障作用，還通過(guò)分泌一些活性物質(zhì)參與機(jī)體的凝血及血管的舒縮等反應(yīng)[7-8]。飲酒后，經(jīng)胃腸道的吸收進(jìn)入血液循環(huán)的酒精可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。酒精對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)作用，低劑量酒精可以保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]，而高劑量則起到抑制作用[10]。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)自身的乙醇脫氫酶及多種氧化酶的催化作用參與酒精的代謝過(guò)程[11-12]。當(dāng)長(zhǎng)期大量飲酒時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管最內(nèi)層結(jié)構(gòu)，直接接觸血液中的酒精或其代謝產(chǎn)物，因此成為直接或間接遭受酒精毒性作用的靶點(diǎn)。

榆干離褶傘（Lyophyllum ulmarium），又名榆生離褶傘、榆干側(cè)耳、大榆蘑等，主要分布于河北、吉林、黑龍江、河南等地。研究發(fā)現(xiàn)，榆干離褶傘具有抗氧化[13]、保肝[14]、溶栓、降血脂[15]等作用。榆干離褶傘溶栓酶（fibrinolytic enzyme from Lyophyllum ulmarium，LUFE）是從榆干離褶傘菌絲體中分離純化的分子質(zhì)量為50 kDa的溶栓酶，它在體外可以水解纖維蛋白及纖維蛋白原[16]。近年來(lái)的研究表明，LUFE具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[17]、抑制血小板活化作用[18]。鑒于大量飲酒對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的危害性，本實(shí)驗(yàn)將以酒精誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，探討LUFE對(duì)酒精所致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，旨在為榆干離褶傘對(duì)心腦血管系統(tǒng)保護(hù)作用的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） 武漢博士德生物工程有限公司；LUFE（比活力為750.6 U/mg pro）由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室分離純化[16]。

澳洲胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）、雙氫羅丹明123（dihydrorhodamine 123，DHR123） 美國(guó)Sigma公司；吖啶橙/溴化乙啶（acridine orange/ethidium bromide，AO/EB）雙染色試劑盒北京索萊寶生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒 南京建成生物工程研究所；BCA試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司；兔抗細(xì)胞色素c、cleaved半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3、cleaved caspase-9、Bax和Bcl2抗體 美國(guó)Santa Cruz公司；乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RT-2100型酶標(biāo)儀 深圳雷杜公司；激光共聚焦顯微鏡SP5II 德國(guó)徠卡儀器有限公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Shel Lab公司；凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVECs培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 LUFE對(duì)HUVECs活力的影響

將細(xì)胞密度為1×105/mL的HUVECs接種到96 孔板中，分為對(duì)照組、損傷組、LUFE低劑量組和LUFE高劑量組，每組設(shè)8 個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后棄去陳舊培養(yǎng)液。損傷組及LUFE各劑量組均加入含200 mmol/L乙醇的無(wú)血清培養(yǎng)液，以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。對(duì)照組以等容生理鹽水代替乙醇。乙醇作用4 h后，LUFE低、高劑量組分別加入1 μg/mL和4 μg/mL的LUFE，對(duì)照組和損傷組以無(wú)血清培養(yǎng)基代替LUFE。培養(yǎng)24 h后，MTT法[17]測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的OD值（OD490nm），按照下式計(jì)算各組HUVECs存活率。

將細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞分組與處理同上。將各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，取上清液檢測(cè)LDH活力，其操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 SOD、GSH-Px活力及MDA含量的檢測(cè)

將細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞分組與處理同1.3.2節(jié)。各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞兩次，用細(xì)胞刮板刮下細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min。棄去上清液，收集細(xì)胞，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞。再次離心10 min，取上清液，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞裂解液的SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

1.3.4 細(xì)胞ROS水平的檢測(cè)

細(xì)胞ROS水平的檢測(cè)采用DHR123染色法。將細(xì)胞接種于6 孔板，細(xì)胞分組及處理同1.3.2節(jié)。將各組細(xì)胞培養(yǎng)12 h后用胰蛋白酶消化，各組收集1×106個(gè)細(xì)胞，用PBS重懸，然后以終濃度為1 μmol/L的DHR123避光條件下孵育45 min。收集細(xì)胞，以PBS漂洗2 次，重懸后在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm條件下在流式細(xì)胞儀檢測(cè)各樣本平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI），該值代表細(xì)胞ROS水平。

1.3.5 AO/EB染色法觀察細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔板爬片內(nèi)，細(xì)胞分組及處理同1.3.2節(jié)。培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌，加入20 μL/mL AO/EB工作液（100 mg/L AO和100 mg/L EB等體積混合液），室溫染色5 min。封片后在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.6 細(xì)胞跨膜電位的檢測(cè)

跨膜電位檢測(cè)采用Rh123染色法。實(shí)驗(yàn)分組及處理過(guò)程同1.3.2節(jié)。10 μg/mL的Rh123染液代替1 μmol/L的DHR123，其余操作同1.3.4節(jié)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的MFI，該值代表細(xì)胞的跨膜電位。

1.3.7 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞細(xì)胞色素c、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

將細(xì)胞接種于6 孔板，實(shí)驗(yàn)分組及處理方法同1.3.2節(jié)。將各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后分別收集細(xì)胞，加入裂解液在4 ℃靜置30 min后以12 000 r/min離心20 min。取上清液，使用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取40 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后分別加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。用TBST洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，沖洗，最后顯影。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用 ±s表示，用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果中熒光強(qiáng)度及其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異性比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LUFE對(duì)細(xì)胞活力的影響

表 1 LUFE對(duì)細(xì)胞存活率和LDH活力的影響Table 1 Effect of LUFE on viability and LDH activity in HUVECs

如表1所示，與對(duì)照組相比，損傷組細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活力升高；與損傷組相比，LUFE低、高劑量組細(xì)胞存活率不同程度地升高、細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH活力下降，結(jié)果表明，LUFE對(duì)酒精誘導(dǎo)的HUVECs的損傷具有保護(hù)作用。

2.2 LUFE對(duì)細(xì)胞SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響

表 2 LUFE對(duì)細(xì)胞SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響Table 2 Effect of LUFE on SOD and GSH-Px activity and MDA contents

由表2可知，與對(duì)照組比較，損傷組細(xì)胞的SOD和GSH-Px活力極顯著降低，而MDA水平極顯著升高（P＜0.01）。與損傷組相比，LUFE高劑量組SOD和GSH-Px活力極顯著升高，MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。

2.3 LUFE對(duì)細(xì)胞ROS的影響

細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS可將DHR氧化成Rh123而發(fā)出熒光，其熒光強(qiáng)度反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。對(duì)照組（圖1A）細(xì)胞的熒光強(qiáng)度平均值為286.80，損傷組（圖1B）的熒光強(qiáng)度為484.97，是對(duì)照組的1.7 倍，這就說(shuō)明酒精作用后細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著升高（P＜0.01）。LUFE低、高劑量組細(xì)胞熒光強(qiáng)度平均值分別為396.66、356.43，與損傷組相比不同程度地減少，差異顯著（P＜0.05）（圖1C、D）。這就提示LUFE可以抑制酒精所致的ROS水平的升高。

圖 1 LUFE對(duì)細(xì)胞ROS的影響Fig. 1 Effect of LUFE on intracellular ROS level

2.4 LUFE對(duì)細(xì)胞線粒體跨膜電位的影響

用Rh123染色，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體跨膜電位。圖2顯示，與對(duì)照組（910.21）相比，損傷組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度下降至633.42，差異極顯著（P＜0.01），這就說(shuō)明酒精作用以后細(xì)胞線粒體跨膜電位顯著降低。而LUFE低、高劑量組的熒光強(qiáng)度分別為828.52、896.21，與損傷組相比極顯著升高（P＜0.01），并隨著用藥劑量的增加呈升高趨勢(shì)。

圖 2 LUFE對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體跨膜電位的影響Fig. 2 Effect of LUFE on mitochondrial transmembrane potential in HUVECs

2.5 細(xì)胞AO/EB染色結(jié)果

AO/EB染色中AO透過(guò)正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。在凋亡細(xì)胞中因染色質(zhì)固縮或斷裂，因此AO使其染上致密濃染的黃綠色熒光。EB僅能透過(guò)破損的細(xì)胞膜嵌入DNA而呈橘紅色。AO/EB染色結(jié)果表明，對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核發(fā)出綠色均勻熒光。損傷組細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變-細(xì)胞核固縮、呈濃染的黃綠色熒光。與損傷組相比，LUFE低、高劑量組細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡細(xì)胞明顯減少，這一結(jié)果表明LUFE能抑制酒精所致的HUVECs凋亡（圖3）。

圖 3 LUFE對(duì)酒精誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的影響（×200）Fig. 3 Effect of LUFE on apoptotic morphology in HUVECs induced by alcohol (× 200)

2.6 LUFE對(duì)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

圖 4 LUFE對(duì)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig. 4 Effect of LUFE on the expression of Bax and Bcl-2 in HUVECs

如圖4所示，與對(duì)照組相比，損傷組Bax表達(dá)增加，而B(niǎo)cl-2表達(dá)減少，具有顯著性差異。與損傷組相比，LUFE低、高劑量組Bax表達(dá)略減少，而B(niǎo)cl-2表達(dá)明顯增加，這就說(shuō)明LUFE降低Bax/Bcl-2比值，即具有抗凋亡作用。

2.7 LUFE對(duì)細(xì)胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，損傷組細(xì)胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達(dá)均增加。與損傷組相比，LUFE低、高劑量組細(xì)胞細(xì)胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表達(dá)均減少，并隨著劑量的增加，其表達(dá)程度越低（圖5）。

圖 5 LUFE對(duì)細(xì)胞色素c、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的影響Fig. 5 Effect of LUFE on the expression of cytochrome c, cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3 in HUVECs

3 討 論

長(zhǎng)期過(guò)量飲酒是心血管病的危險(xiǎn)因素[19]。研究表明過(guò)量飲酒可引起酒精性心肌病[20]、心血管意外等[21]。心血管系統(tǒng)是酒精作用的主要靶器官之一。在心血管疾病的發(fā)生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的損傷起重要作用。酒精代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量ROS[22-23]，引發(fā)氧化應(yīng)激，氧化損傷細(xì)胞膜、DNA、酶、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)[24]，最終引起細(xì)胞凋亡或細(xì)胞壞死[25-26]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)LUFE對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有保護(hù)作用[17]，由此設(shè)想LUFE是否對(duì)酒精誘導(dǎo)的HUVECs損傷有保護(hù)作用。為此，本實(shí)驗(yàn)探討了LUFE對(duì)酒精干預(yù)后的HUVECs的影響及其相關(guān)機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，酒精作用后血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活率下降、細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH漏出量增多。同時(shí)對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)結(jié)果（AO/EB染色結(jié)果）顯示，酒精作用后細(xì)胞數(shù)減少、其形態(tài)發(fā)生變化、部分細(xì)胞發(fā)生凋亡。而LUFE干預(yù)后細(xì)胞存活率上升，凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，提示LUFE對(duì)酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

酒精在代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量ROS，引起組織細(xì)胞的損傷。本實(shí)驗(yàn)中酒精作用后ROS水平顯著升高。高水平的ROS消耗大量抗氧化酶，導(dǎo)致SOD、GSH-Px活力下降；同時(shí)因活性氧所致的脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)，引起其產(chǎn)物MDA水平增高。本研究中，不同劑量LUFE作用于損傷HUVECs后抑制ROS的生成，說(shuō)明LUFE可通過(guò)降低ROS水平，來(lái)保護(hù)酒精所致的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。SOD、GSH-Px水平是反映機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要指標(biāo)，其水平的高低反映機(jī)體的抗氧化能力。LUFE干預(yù)后提高SOD、GSH-Px活力，同時(shí)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，這提示LUFE可能通過(guò)提高抗氧化酶活力來(lái)抑制ROS的生成。

線粒體是ROS產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，也是容易受ROS攻擊的目標(biāo)[27]。酒精可損傷mtDNA，影響細(xì)胞能量代謝、增加ROS的生成[28]。本實(shí)驗(yàn)中，酒精代謝過(guò)程中產(chǎn)生的大量ROS破壞線粒體膜的完整性，降低線粒體跨膜電位，這與其他文獻(xiàn)結(jié)果一致[29]。研究表明，線粒體膜電位下降是線粒體途徑細(xì)胞凋亡發(fā)生的早期事件之一[30]。本實(shí)驗(yàn)中酒精作用后促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，而這種Bax/Bcl-2比值的增加引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放，細(xì)胞色素c釋放到胞質(zhì)中，后者通過(guò)介導(dǎo)凋亡復(fù)合體的生成，促進(jìn)cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的活化而啟動(dòng)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，LUFE降低Bax/Bcl-2比值，提高線粒體跨膜電位，抑制線粒體細(xì)胞色素c釋放，從而抑制cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的活化，即抑制線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LUFE對(duì)酒精所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與其抗氧化、抑制酒精誘導(dǎo)的線粒體途徑細(xì)胞凋亡有關(guān)。