郝 帥，李 爽，王 靜，吳婷婷，張佳雯，王成濤

（北京市食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

藻藍(lán)蛋白源于螺旋藻、藍(lán)藻、紅藻等海洋生物，是一種天然無毒的藻類蛋白質(zhì)[1]。由于其水溶性好、顏色鮮亮等特點，藻藍(lán)蛋白作為公認(rèn)的食品著色劑被廣泛應(yīng)用于多種食品行業(yè)中；近年來研究表明，藻藍(lán)蛋白可以作為一種功能因子參與腫瘤抑制、減輕炎癥、抵抗氧化損傷和衰老等多種生理調(diào)控過程，并且不產(chǎn)生毒副作用[2-5]。有研究報道，藻藍(lán)蛋白對肺癌、乳腺癌、肝癌、以及黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用[6-12]。藻藍(lán)蛋白生物活性的發(fā)現(xiàn)引起了廣大研究者的極大興趣，在海洋類功能性食品的開發(fā)和利用方面具有重要的研究價值。

近年來，汽車尾氣的排放、工業(yè)廢氣污染以及PM2.5霧霾的擴(kuò)散等環(huán)境問題日益嚴(yán)重，這些環(huán)境污染會對人體肺部造成巨大損傷并引起癌變。由于肺癌細(xì)胞易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，使得肺癌成為目前全球第一大惡性腫瘤，發(fā)病率和致死率在各類腫瘤中占據(jù)首位[13]。而隨著我國人口老齡化程度加劇，1998年—2015年，我國的肺癌發(fā)病率與死亡率始終保持逐年上升的趨勢，肺癌已經(jīng)成為危害我國居民健康最主要的惡性腫瘤[14-15]。肺癌的病理分型按組織學(xué)可分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類，近年被診斷的肺癌中，約85%屬于非小細(xì)胞肺癌[16-17]。因此，尋找與肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移過程相關(guān)的蛋白，研究藻藍(lán)蛋白在肺癌中的生物學(xué)功能，深入探索其作用機(jī)制，可為非小細(xì)胞肺癌的診斷、預(yù)防甚至治療提供思路與依據(jù)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)（RNA-seq技術(shù)）是近年來發(fā)展起來的轉(zhuǎn)錄水平測序技術(shù)，具有高通量、成本低、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢。目前，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已經(jīng)用于多種腫瘤模型中關(guān)鍵基因的篩選和調(diào)控機(jī)制研究中，具有鮮明的技術(shù)優(yōu)越性。例如，Jian Jinlong等采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究了p204蛋白的抗腫瘤調(diào)控機(jī)制[18]；Aldaz等利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對野生型與p53突變型的乳腺癌小鼠進(jìn)行了差異基因的篩選，發(fā)現(xiàn)了一系列p53所調(diào)控的新基因[19]。此外，Ying Jun等同樣采用了轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探究了藻藍(lán)蛋白在抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞增殖中的調(diào)控機(jī)制，他們發(fā)現(xiàn)p53信號通路活性的改變可能是藻藍(lán)蛋白抑制卵巢癌的一條重要途徑[20]。本研究以一株典型的非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞為模型，采用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對藻藍(lán)蛋白在H460細(xì)胞中的潛在靶點進(jìn)行分析，以期揭示藻藍(lán)蛋白的抗肺癌機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的治療和功能性食品添加劑藻藍(lán)蛋白的開發(fā)提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人類非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞系，購于美國模式培養(yǎng)物集存庫，保存于北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心。

藻藍(lán)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 美國Envirologix公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基 美國Gibco公司；胎牛血清 天津康源生物技術(shù)有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 天根生物技術(shù)有限公司；TRIzol試劑 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱 德國Heraeus公司；漩渦振蕩儀德國IKA公司；超凈工作臺 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；數(shù)字型電子天平 德國Sartorius公司；CFX96Touch熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Bioanalyzer 2100核酸檢測儀 美國安捷倫公司；RNA-seq高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞培養(yǎng)于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素以及100 units/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞每3～4 d傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.3.2 細(xì)胞存活率實驗

收集處于對數(shù)生長期的H460細(xì)胞，胰酶消化，以每孔5 000 個細(xì)胞量鋪于96 孔板中，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，分別加入終濃度為0、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 μmol/L（質(zhì)量濃度分別為0、20、40、80、160、320 mg/L）的藻藍(lán)蛋白，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，加入10 μL MTT溶液（儲備液質(zhì)量濃度為5 mg/mL）孵育4 h，加入100 μL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）-HCl裂解液繼續(xù)孵育12 h，檢測570 nm波長處吸光度，統(tǒng)計數(shù)據(jù)并根據(jù)下式計算藻藍(lán)蛋白作用細(xì)胞48 h的細(xì)胞存活率（R）。

1.3.3 細(xì)胞生長曲線測定

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96 孔板（5×104個/孔）12～16 h，細(xì)胞貼壁生長后添加終濃度為4.8 μmol/L藻藍(lán)蛋白處理，并加入10 μL的MTT（儲備液質(zhì)量濃度為5 mg/mL），4～6 h后加入100 μL的SDS-HCl裂解液，12 h后測定570 nm波長處吸光度。以生長時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3.4 克隆實驗

取對數(shù)期細(xì)胞接種于6 孔板（2×102個/孔），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞完全貼壁，隨后分別采用濃度為0、2.4、4.8、9.6 μmol/L的藻藍(lán)蛋白處理細(xì)胞。培養(yǎng)2～3 周，當(dāng)6 孔板中形成大約50 個克隆數(shù)時終止培養(yǎng)，并用吉姆薩染液染色計數(shù)克隆數(shù)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h，分別加入0、2.4、4.8 μmol/L的藻藍(lán)蛋白處理72 h，胰酶消化后在室溫1 000 r/min離心10 min，用100 μL雙染孵育液將洗干凈的細(xì)胞沉淀重懸，加入5 μL AnnexinV-FITC染液，再加入5 μL 7-AAD染液，冰上20 min避光染色。充分混勻后上機(jī)檢測細(xì)胞的凋亡情況，統(tǒng)計早期凋亡、晚期凋亡的細(xì)胞比例。

1.3.6 用于轉(zhuǎn)錄組測定的H460細(xì)胞的前處理

前一天晚上將H460細(xì)胞進(jìn)行傳代處理，細(xì)胞密度大約50%左右。第二天待細(xì)胞完全貼壁后，采用藻藍(lán)蛋白處理細(xì)胞（其中對照組采用相同體積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）處理細(xì)胞），每個處理組做3 個生物學(xué)平行組，藻藍(lán)蛋白處理48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。研究結(jié)果中1～3號樣本為對照組；4～6號樣本為藻藍(lán)蛋白處理組。

1.3.7 細(xì)胞cDNA文庫的構(gòu)建

在4 ℃條件下，采用TRIzol試劑提取H460細(xì)胞總RNA。RNA樣本濃度和純度采用Bioanalyzer 2100核酸檢測儀測定，其中滿足OD260nm/OD280nm≥1.8、OD260nm/OD230nm≥1.5并且RNA完整度數(shù)量（RNA integrity number，RIN）≥8.0條件的RNA樣本可用于后續(xù)實驗。隨后在RNA樣本中加入破碎液將mRNA斷裂成碎片，隨后用于反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈；cDNA第二條鏈利用dNTPs，RNA酶H以及DNA聚合酶進(jìn)行合成。雙鏈cDNA隨后進(jìn)行末端修復(fù)和連接，凝膠純化后采用PCR擴(kuò)增技術(shù)構(gòu)建cDNA文庫。

1.3.8 RNA-seq測序以及生物信息學(xué)分析

轉(zhuǎn)錄組測序采用5 μg RNA樣品進(jìn)行實驗。原始讀長中去除含有測序引物以及低質(zhì)量的讀長后，進(jìn)行序列拼接形成高質(zhì)量的讀長片段。采用TopHat將高質(zhì)量的讀長片段與人類基因組序列進(jìn)行比對，隨后通過UCSC基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列注釋。通過非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、非冗余序列和SwissProt數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用BLAST算法以E值10-5為限定條件進(jìn)行序列的同源性比對。轉(zhuǎn)錄組分析獲得的轉(zhuǎn)錄本和基因采用GO聚類、KEGG聚類進(jìn)行分析，確定轉(zhuǎn)錄本的功能信息。

1.3.9 差異基因的表達(dá)分析

差異基因表達(dá)量（differentially expressed genes，DEGs）利用RSEM 1.2.31軟件進(jìn)行分析，該方法基于每百萬讀長中來自于某基因每千堿基長度的片段數(shù)（fragments per kilobases per millionreads，F(xiàn)RKM）的方法進(jìn)行計算，獲得基因表達(dá)量FRKM。基因的差異比對采用DESeq軟件進(jìn)行分析，對DESeq檢測結(jié)果按照差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)（差異基因的表達(dá)量變化高于2 倍且錯誤發(fā)現(xiàn)率指標(biāo)小于0.05）進(jìn)行篩選，統(tǒng)計基因顯著性差異表達(dá)調(diào)節(jié)的情況。

1.3.10 實時熒光定量PCR檢測基因的表達(dá)

采用5 μmol/L藻藍(lán)蛋白處理H1299細(xì)胞48 h后，利用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行定量PCR的檢測。2 μg總RNA用于進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測（GAPDH作為內(nèi)參）?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量采用2－ΔΔCt法進(jìn)行計算，每個樣本進(jìn)行4 個生物學(xué)重復(fù)。其中定量PCR的引物設(shè)計如表1所示。

表 1 用于定量PCR反應(yīng)的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR

1.3.11 Western Blot檢測

收集細(xì)胞，加入適量體積的RIPA裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白抽提；利用Bradford法測定其濃度。將蛋白采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的SDS分離膠進(jìn)行分離，隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，根據(jù)目的條帶大小剪膜，用5%脫脂奶粉封閉目的條帶1.5 h、孵育一抗過夜。第2天于37 ℃恒溫靜置孵育二抗1 h，經(jīng)TBST溶液清洗3 次，孵發(fā)光液顯色，洗片機(jī)曝光目的條帶蛋白，掃描儀掃描膠片并保存圖片。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，其中P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻藍(lán)蛋白對H460細(xì)胞生長的抑制作用

圖 1 藻藍(lán)蛋白對H460細(xì)胞生長的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of phycocyanin on H460 cell growth

首先采用藻藍(lán)蛋白處理正常培養(yǎng)的H460細(xì)胞，利用細(xì)胞存活率、細(xì)胞增殖和集落形成實驗檢測藻藍(lán)蛋白對細(xì)胞增殖的影響。圖1A顯示，隨著藻藍(lán)蛋白濃度的增加，細(xì)胞存活率出現(xiàn)濃度依賴性下降，4.8 μmol/L和9.6 μmol/L濃度處理能夠引起細(xì)胞存活率發(fā)生極顯著降低；圖1B顯示藻藍(lán)蛋白能夠顯著降低細(xì)胞的體外增殖能力；圖1C顯示，隨著藻藍(lán)蛋白濃度的增加，細(xì)胞的群落形成能力逐漸降低。以上結(jié)果均表明藻藍(lán)蛋白能夠顯著抑制非小細(xì)胞肺癌H460的體外增殖能力。

2.2 藻藍(lán)蛋白對H460細(xì)胞凋亡的影響

圖 2 藻藍(lán)蛋白對H460細(xì)胞凋亡的影響Fig. 2 Effect of phycocyanin on the apoptosis of H460 cells

采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot實驗檢測了藻藍(lán)蛋白對H460細(xì)胞凋亡的影響。圖2A顯示，藻藍(lán)蛋白處理后，細(xì)胞生長狀態(tài)發(fā)生改變，正常貼壁生長的細(xì)胞數(shù)量明顯降低；隨后采用流式細(xì)胞術(shù)對處理后細(xì)胞的凋亡比例進(jìn)行了檢測，圖2B顯示，隨著藻藍(lán)蛋白濃度的增加，H460細(xì)胞早期和晚期凋亡的比例顯著增加；同時，圖2C顯示，藻藍(lán)蛋白能夠增加促凋亡蛋白Bax和Bad的表達(dá)量。以上結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白不僅能抑制H460細(xì)胞的生長，還能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。為了進(jìn)一步探究藻藍(lán)蛋白在H460細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)理，對藻藍(lán)蛋白處理前后的H460細(xì)胞進(jìn)行了高通量轉(zhuǎn)錄組測序研究。

2.3 RNA質(zhì)量控制

表型實驗結(jié)果表明，4.8 μmol/L濃度的藻藍(lán)蛋白已經(jīng)能夠引起H460細(xì)胞的生長和凋亡發(fā)生極顯著改變，因此，采用此濃度進(jìn)行H460細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。采用1.3.6節(jié)方法將藻藍(lán)蛋白與PBS對照分別處理正常培養(yǎng)的H460細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞提取總RNA用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。首先對細(xì)胞總RNA的純度和完整度等指標(biāo)進(jìn)行了檢測。圖3分別采用核酸凝膠電泳和核酸分析儀對RNA的完整性進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，RNA 18S和28S亞基條帶清晰，并且在相應(yīng)的時間出峰完整，集中程度高；表2顯示了RNA質(zhì)量控制的基本參數(shù)，6 個樣本的RNA總量均超過15 μg，OD260nm/OD280nm大于1.8，OD260nm/OD230nm大于1.5，RNA 完整值（RNA integrity number，RIN）均大于8，表明RNA樣本完整，沒有發(fā)生降解，并且純度和濃度較高，可以進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析。

圖 3 細(xì)胞總RNA的完整度檢測Fig. 3 Integrity analysis of total bacterial RNA

表 2 RNA質(zhì)量控制基本參數(shù)Table 2 Essential parameters of RNA quality control

2.4 差異基因的篩選分析結(jié)果

采用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對藻藍(lán)蛋白處理組與對照組的H460細(xì)胞中的差異基因進(jìn)行了篩選。由圖4可知，共獲得了2 532 個表達(dá)量顯著差異的基因，其中顯著上調(diào)基因1 491 個，占差異基因總數(shù)的58.9%；顯著下調(diào)基因1 041 個，占差異基因總數(shù)的41.1%。

圖 4 藻藍(lán)蛋白處理后差異基因模式散點圖Fig. 4 Scatter diagram of differentially expressed genes induced by phycocyanin treatment

為了進(jìn)一步研究藻藍(lán)蛋白對H460細(xì)胞的調(diào)控作用，對差異基因進(jìn)行了GO功能分析。表3顯示了GO分析中差異基因參與的排名前10 位的生物學(xué)過程。其中，差異基因主要調(diào)控了細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控過程、細(xì)胞程序性死亡調(diào)控、細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控、細(xì)胞因子應(yīng)答反應(yīng)這幾類生物學(xué)過程。目前，已有一些研究表明，藻藍(lán)蛋白能夠抑制另一類非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的增殖[21-23]，而本研究的分析結(jié)果進(jìn)一步證實了前期的報道，也反映了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的客觀性和準(zhǔn)確性。

表 3 排名前10位的差異基因的GO功能分析Table 3 Top 10 ranked differentially expressed genes in GO analysis

2.5 差異基因的聚類分析結(jié)果

差異基因在不同樣本中具有不同的表達(dá)量，表達(dá)模式相似的基因通常具有功能的相關(guān)性，因此根據(jù)差異基因的表達(dá)情況進(jìn)行了聚類分析。圖5顯示了2 532 個差異基因的聚類分析結(jié)果，根據(jù)表達(dá)量的不同，除9 個基因不具有明顯的表達(dá)規(guī)律以外，大部分差異基因能夠聚成4大類，分別為：表達(dá)顯著下調(diào)的基因類別A（1 022 個基因），表達(dá)顯著上調(diào)的基因類別B（1 393 個基因），表達(dá)極顯著下調(diào)的基因類別C（14 個基因），以及表達(dá)極顯著上調(diào)的基因類別D（94 個基因），4 類基因的表達(dá)模式如圖6所示。

在這些差異基因中，挑選出了10 個感興趣的差異基因并進(jìn)行了分類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cdk2、Cdc25、PCNA、TLR4等影響細(xì)胞增殖的基因均出現(xiàn)了顯著下調(diào)（A類）；p27、p21等抑制細(xì)胞增殖的基因出現(xiàn)了顯著上調(diào)（B類）；Bcl-2、NKD1等癌基因出現(xiàn)了極顯著下調(diào)（C類）；而CCT6、GBP2等促凋亡基因出現(xiàn)了極顯著上調(diào)（D類）。這10 個差異基因的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果如表4所示。這些結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能夠調(diào)控PCNA等多種基因的表達(dá)而抑制H460細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其的凋亡。研究結(jié)果為探究藻藍(lán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的調(diào)控提供了參考，也為肺癌治療提供了潛在的靶點。

圖 6 4 類差異基因表達(dá)的聚類模式圖Fig. 6 Four cluster patterns of differentially expressed genes

表 4 10 個感興趣差異基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況Table 4 RNA-seq analysis of 10 differentially expressed genes

2.6 定量PCR驗證差異基因的表達(dá)

對篩選得到的上述幾個關(guān)鍵基因進(jìn)行了定量PCR的驗證。如圖7所示，細(xì)胞周期調(diào)控基因Cdk2、Cdc25、PCNA以及TLR4在藻藍(lán)蛋白處理后出現(xiàn)了顯著下調(diào)，周期抑制基因p27和p21則出現(xiàn)了上調(diào)；促凋亡基因CCT6和GBP2在藻藍(lán)蛋白處理后出現(xiàn)了顯著上調(diào)，而抑凋亡基因Bcl-2和NKD1的表達(dá)趨勢出現(xiàn)了相反的情況。此結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的基因表達(dá)量結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實了這些關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)受到了藻藍(lán)蛋白的調(diào)控，進(jìn)而引起了H460細(xì)胞的增殖抑制和凋亡效應(yīng)，為解釋藻藍(lán)蛋白在非小細(xì)胞肺癌的調(diào)控機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。

圖 7 差異基因的定量PCR結(jié)果Fig. 7 qPCR analysis of differentially expressed genes

2.7 藻藍(lán)蛋白調(diào)控H460細(xì)胞的信號通路分析結(jié)果

圖 8 差異基因的KEGG富集分析Fig. 8 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

采用KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因可能參與的信號通路進(jìn)行了富集分析，圖8顯示了富集程度排在前20位的信號通路。結(jié)果表明，在篩選得到的差異基因中，主要參與了與腫瘤生長和凋亡相關(guān)的TNF信號通路、IL-17信號通路、Wnt信號通路、NF-κB信號通路以及PI3K-Akt信號通路等。其中PI3K-Akt信號通路所含有的差異基因的數(shù)量最多。Kim等通過研究發(fā)現(xiàn)，p21可以作為一個下游調(diào)控因子參與Akt信號通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[24]，Chen等也在血細(xì)胞癌U937細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Akt與p21具有相互調(diào)控的效應(yīng)[25]，這表明藻藍(lán)蛋白可能通過調(diào)控Akt信號通路影響細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而抑制H460細(xì)胞的增殖。此外，也有相關(guān)研究報道Akt與Bcl-2在卵巢癌、胃癌和喉癌中具有相互調(diào)控的作用[26-28]，表明Akt也參與了細(xì)胞凋亡過程。因此，KEGG分析表明Akt可能是藻藍(lán)蛋白調(diào)控H460細(xì)胞增殖和凋亡的一個重要途徑。

此外，在轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中，一些典型的參與Akt信號通路的上游調(diào)控因子如TLR2、TLR4以及IRS1也被作為差異基因刪選出來，它們的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果如表5所示。藻藍(lán)蛋白處理后，這些基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)了極顯著下調(diào)。隨后，對其中2 個差異基因（TLR2和TLR4）以及PI3K-Akt信號通路中的兩個經(jīng)典蛋白AKT和磷酸酶-張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的磷酸化水平進(jìn)行了檢測（圖9）。PTEN是一種非常重要的腫瘤抑制蛋白，同時也是PI3K-Akt信號通路的抑制子，磷酸化后被激活[29-30]。圖9顯示，藻藍(lán)蛋白處理H460細(xì)胞后，TLR2、TLR4和IRS1的蛋白水平出現(xiàn)了明顯降低，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致，同時，PTEN的磷酸化水平出現(xiàn)了顯著增加，并且Akt的磷酸水平出現(xiàn)了顯著降低。以上研究結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白能夠顯著降低PI3K-Akt信號通路的活性，進(jìn)而對細(xì)胞增殖起到抑制作用。

表 5 與Akt信號通路相關(guān)的3 個差異基因的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況Table 5 RNA-seq analysis of 3 differentially expressed genes related to Akt signal pathway

圖 9 藻藍(lán)蛋白處理H460細(xì)胞后Akt信號通路的檢測Fig. 9 Akt pathway analysis in H460 cells after phycocyanin treatment

3 結(jié) 論

本研究以高通量轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為研究手段，對藻藍(lán)蛋白處理后的H460細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果表明，藻藍(lán)蛋白處理后，共篩選得到2 532 個表達(dá)量顯著差異的基因，其中顯著上調(diào)基因1 491 個，占差異基因總數(shù)的58.9%；顯著下調(diào)基因1 041 個，占差異基因總數(shù)的41.1%。這些差異基因主要參與了細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的生物學(xué)調(diào)控過程；對差異基因進(jìn)行聚類分析顯示，4 類不同的基因表達(dá)模式被聚類，包含了與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)的重要基因：Cdk2、Cdc25、PCNA、TLR4、p27、p21、CCT6、GBP2、Bcl-2、NKD1；定量PCR驗證結(jié)果顯示，差異基因的表達(dá)趨勢與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致；此外，差異基因的KEGG富集分析顯示，藻藍(lán)蛋白能夠參與調(diào)控TNF、IL-17、Wnt、NF-κB以及PI3K-Akt等信號通路，其中PI3K-Akt信號通路富集的差異基因數(shù)量最多；Western Blot結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了藻藍(lán)蛋白能夠顯著降低H460細(xì)胞中Akt信號通路的活性，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。本研究全面探究了藻藍(lán)蛋白在H460細(xì)胞中的調(diào)控機(jī)制，為抗腫瘤類功能性食品因子的開發(fā)和利用提供了重要的依據(jù)，同時也為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供了理論參考。