謝廣發(fā)，陸 健，孫軍勇,，陸 胤，彭 祺，錢 斌，金建順，王 蘭，傅祖康，魯振東，劉彩琴

（1.浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 紹興 312028；2. 浙江樹(shù)人大學(xué)紹興黃酒學(xué)院，浙江 紹興 312028；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；4.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；5.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江 紹興 312000；6.會(huì)稽山紹興酒有限公司，浙江 紹興 312000）

黃酒是一種膠體溶液，在受到外界條件溫度、光照、pH值、氧等因素影響時(shí)，膠體溶液穩(wěn)定性容易受到破壞，從而使其中的某些物質(zhì)析出，造成非生物混濁[1-2]。非生物混濁在釀造酒中普遍存在[3-4]，而黃酒的混濁和沉淀問(wèn)題比其他釀造酒更加嚴(yán)重[5]。蛋白質(zhì)是已知影響黃酒非生物混濁的最大因素之一[6]，瓶裝黃酒沉淀中蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50.56%[7]，但有關(guān)研究認(rèn)為，混濁的形成與總蛋白含量并沒(méi)有直接的因果關(guān)系，而可能與黃酒中的某類特殊蛋白質(zhì)相關(guān)[8]，多酚和鐵離子含量等也對(duì)酒體的非生物穩(wěn)定性有影響[9]，敏感多酚和敏感蛋白的相互作用是影響黃酒非生物混濁的主要原因[10]。

目前黃酒行業(yè)沒(méi)有統(tǒng)一的非生物穩(wěn)定性檢測(cè)方法，文獻(xiàn)報(bào)道用于黃酒非生物穩(wěn)定性預(yù)測(cè)的方法有低溫存放法[11]、熱處理法[12-14]、冷熱循環(huán)法[15]和乙醇-濁度法[16-17]，其中研究最多的為冷熱循環(huán)法。白少勇[15]采用冷熱循環(huán)法測(cè)定酒樣處理前后的濁度，條件為0 ℃放置24 h、60 ℃放置24 h，兩個(gè)循環(huán)，恢復(fù)室溫后進(jìn)行測(cè)定；江超[18]通過(guò)60 ℃水浴12 h、4 ℃放置12 h，以循環(huán)3 次后的濁度差來(lái)判斷黃酒非生物穩(wěn)定性；高恩麗等[19]用60 ℃放置24 h、0 ℃放置24 h循環(huán)處理黃酒，4 d后在55～60 ℃下測(cè)定濁度；姬中偉等[20]采用-5、45 ℃交替存放50 d后，比較酒體的混濁程度來(lái)判斷酒體的穩(wěn)定性；陳玲等[21]采用85 ℃放置0.5 h、0 ℃放置0.5 h，20 個(gè)循環(huán)后觀察混濁情況。實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，這些預(yù)測(cè)方法與黃酒自然存放過(guò)程中的穩(wěn)定性存在較大差異，不能很好地預(yù)測(cè)黃酒的穩(wěn)定性。因此，通過(guò)對(duì)各種黃酒穩(wěn)定性的評(píng)價(jià)及與穩(wěn)定性相關(guān)的理化指標(biāo)的分析，建立一種更準(zhǔn)確實(shí)用的穩(wěn)定性預(yù)測(cè)方法，有利于穩(wěn)定性處理效果的評(píng)價(jià)和生產(chǎn)指導(dǎo)，避免貨架期間因酒體混濁而引起退貨返工。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃酒樣品主要購(gòu)自當(dāng)?shù)爻校a(chǎn)地主要為上海、浙江、江蘇等，樣品具體信息見(jiàn)表1。

表 1 黃酒樣品基本信息Table 1 Information about Chinese rice wine samples tested in this study

乙腈、胰蛋白酶、α-氰基-4-羥基肉桂酸、碳酸氫銨、三氟乙酸 美國(guó)Sigma公司；30%丙烯酰胺單體儲(chǔ)液、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、甲叉雙丙烯酰胺、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、牛血清白蛋白、過(guò)硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)R-250、β-巰基乙醇、丙酮、尿素、三氯乙酸、蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、N-三(羥甲基)甘氨酸 生工生物工程（上海）股份有限公司；鹽酸羥胺、鄰菲啰啉、Folin-Ciocalteu試劑、聚乙烯吡咯烷酮、乙酸鈉、沒(méi)食子酸、單寧酸、硫酸亞鐵銨 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MPG-100H低溫加熱循環(huán)槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JD-801凝膠成像系統(tǒng) 江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；Mini-Protein 3 Cell蛋白電泳系統(tǒng)） 美國(guó)Bio-Rad公司；WGZ-2-PJ型濁度計(jì) 上海昕瑞儀器儀表有限公司；KT260凱氏定氮儀 丹麥Foss有限公司；Ultraflextreme基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀德國(guó)Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酒混濁樣品制備

將瓶裝黃酒或經(jīng)非生物穩(wěn)定性處理后的黃酒靜置5 d，采用虹吸法將上清酒液去除，留下底部約80 mL酒樣，振蕩混勻后，12 000 r/min離心30 min，收集混濁沉淀。再將收集的沉淀懸浮于超純水，12 000 r/min離心30 min，重復(fù)上述過(guò)程。超純水洗滌兩次后的沉淀用體積分?jǐn)?shù)2%氨水溶解，添加硫酸銨粉末達(dá)到80%飽和度，然后用1 000 Da的透析袋于4 ℃下脫鹽48 h，最后冷凍干燥，即得到混濁蛋白樣品[22]。

1.3.2 混濁蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）按照文獻(xiàn)[22-23]中的方法進(jìn)行，將樣品蛋白溶于pH 7.0的0.05 mol/L Tris-HCl溶液中，通過(guò)Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度以確定上樣量。采用的分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，采用的濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。電泳結(jié)束后將凝膠固定30 min后，在染色液（考馬斯亮藍(lán)R-250）中染色30 min，脫色液脫色至背景清晰，采用JD-801凝膠成像儀對(duì)凝膠拍照，圖片通過(guò)捷達(dá)801圖像分析軟件3.3分析。

1.3.3 混濁蛋白的基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析

參考文獻(xiàn)[24]對(duì)混濁蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，切取凝膠上的蛋白條帶，用含有100 mmol/L碳酸氫銨的體積分?jǐn)?shù)30%乙腈溶液洗滌膠粒直至無(wú)色。加入50 μL無(wú)水乙腈使膠粒脫水呈現(xiàn)白色。向EP管中加入5 μL稀釋后的胰蛋白酶溶液，使膠粒完全吸收酶液（置于4 ℃冰箱中30～60 min），吸掉多余胰蛋白酶溶液，加入25 mmol/L碳酸氫銨溶液20 μL，37 ℃保溫16～20 h。將酶解液轉(zhuǎn)移到新離心管中，旋轉(zhuǎn)真空濃縮至約3 μL。取0.7 μL樣品點(diǎn)樣，干燥后加0.7 μL基質(zhì)，干燥后通過(guò)質(zhì)譜儀對(duì)點(diǎn)靶樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。采用正離子反射模式與自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)模式采集一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，掃描范圍為700～3 500 Da。選取信號(hào)強(qiáng)度好的一級(jí)質(zhì)譜峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，使用BioTools軟件進(jìn)行整合，用Mascot軟件在美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行全物種質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜索。

1.3.4 黃酒非生物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

冷熱循環(huán)法：黃酒樣品0 ℃放置12 h后80 ℃放置12 h，計(jì)為一個(gè)循環(huán)，每完成一個(gè)循環(huán)，測(cè)定樣品濁度，記錄濁度增加4 NTU所需循環(huán)數(shù)，記為?4 NTU循環(huán)數(shù)。

熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：根據(jù)Hsu等[25]的方法稍作修改，取酒樣50 mL，90 ℃水浴6 h，冷卻至室溫，測(cè)定熱處理前后的濁度，計(jì)算濁度增加量，以濁度的增加量表示，單位為NTU。濁度的增加量越大，酒體的穩(wěn)定性越差。

冷凍實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[15]：將黃酒樣品在0 ℃條件下存放12 h，測(cè)定冷凍后樣品的濁度，單位為NTU。

乙醇-濁度測(cè)定參考文獻(xiàn)[15]：取黃酒酒樣50 mL，加入無(wú)水乙醇25 mL，振蕩混勻，2 h后測(cè)定濁度，以添加乙醇前后濁度增加量表示，單位為NTU。

自然存放：將酒樣存放于自然條件下，記錄初始濁度以及自生產(chǎn)日期開(kāi)始后第9、12個(gè)月的樣品濁度。

1.3.5 混濁相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

黃酒混濁相關(guān)理化指標(biāo)敏感蛋白、敏感多酚、總酚、兒茶素、隆丁區(qū)分和鐵離子的測(cè)定參照文獻(xiàn)[24]，其中敏感蛋白含量以添加單寧之后濁度的變化量表示，敏感多酚含量以添加聚乙烯吡絡(luò)烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）之后濁度的變化量表示，單位均為NTU。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測(cè)定3 次，取平均值。采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同非生物穩(wěn)定性預(yù)測(cè)方法中析出蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結(jié)果

目前，用于酒類非生物穩(wěn)定性快速預(yù)測(cè)的方法主要有冷熱循環(huán)法、熱處理法、乙醇濁度法和冷凍實(shí)驗(yàn)法。在本研究中，對(duì)不同的預(yù)測(cè)方法中析出的蛋白質(zhì)與自然沉淀中的混濁蛋白進(jìn)行對(duì)比，以選擇能較準(zhǔn)確預(yù)測(cè)非生物穩(wěn)定性的預(yù)測(cè)方法。

采用不同的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法處理瓶裝黃酒，處理結(jié)束后收集沉淀物，按照1.3.1節(jié)中的方法提取蛋白質(zhì)，將不同穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法中析出的蛋白與收集的瓶裝酒中自然沉淀蛋白分別上樣進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖1。

兩種不同的酒樣中，自然沉淀蛋白質(zhì)都主要分布在14.4 kDa（條帶b1和c2）和27 kDa（條帶a1和b2），與孫軍勇等[26]研究發(fā)現(xiàn)黃酒混濁蛋白主要分布在13～16 kDa和28～55.4 kDa之間的結(jié)果一致。Schulte等[27]研究發(fā)現(xiàn)形成啤酒混濁的蛋白，主要是分子質(zhì)量為16.5 kDa和30.7 kDa的糖蛋白。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，冷熱循環(huán)法和熱處理法沉淀蛋白與自然沉淀蛋白的分布相同，也集中在14.4 kDa和27 kDa處。冷凍實(shí)驗(yàn)法和乙醇-濁度法析出的主要蛋白分別是a2～c2和a1～c1。樣品A中析出的蛋白比自然沉淀蛋白多出了條帶c1（分子質(zhì)量為8.0 kDa）；在樣品B中，多沉淀出了分子質(zhì)量為34.4 kDa的條帶a2。經(jīng)軟件計(jì)算，乙醇濁度法沉淀蛋白中的c1和a2，分別占總沉淀蛋白的40.2%和23.7%，這說(shuō)明乙醇濁度法沉淀蛋白與自然沉淀蛋白的成分不同，并且各成分所占的比例也差異明顯；冷凍實(shí)驗(yàn)法沉淀蛋白中的a2占總沉淀蛋白的38.6%，與自然沉淀蛋白成分相同的蛋白質(zhì)總含量?jī)H為61.4%，這與混濁蛋白的成分組成有很大差別。

圖 1 不同穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法沉淀出的蛋白質(zhì)Fig. 1 SDS-PAGE of precipitated proteins in different stability tests

挖取條帶a2和c1進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，鑒定結(jié)果分別為絲氨酸蛋白酶抑制劑-Z1C和病程相關(guān)蛋白-4（pathogenesis related protein-4，PR-4）。PR蛋白能抵抗糖苷酶、蛋白酶、尿素、重金屬、高溫（60 ℃）和低pH值[28-30]，PR-4蛋白是一個(gè)具有保守Barwin結(jié)構(gòu)域的病程相關(guān)蛋白家族，除了對(duì)病原微生物的應(yīng)激反應(yīng)外，水稻PR-4基因還涉及非生物應(yīng)激反應(yīng)和耐受性[29]。PR-4是混濁蛋白的組成成分之一[31-33]，但是從混濁蛋白的電泳圖譜可以看出，PR-4的條帶顏色較淺，說(shuō)明其在混濁蛋白中的含量很低，不是混濁蛋白主要的組成部分。絲氨酸蛋白酶抑制劑-Z1C來(lái)源于小麥，并不是混濁蛋白的組分，但在乙醇濁度實(shí)驗(yàn)和冷凍實(shí)驗(yàn)中析出，說(shuō)明它可能是一種低醇溶性和低溫下溶解度降低的蛋白質(zhì)，它的存在說(shuō)明這兩種預(yù)測(cè)方法不能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)黃酒的非生物穩(wěn)定性。

綜上，不同的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法沉淀出的蛋白質(zhì)都含有14.4 kDa和27.6 kDa這兩個(gè)條帶，與混濁蛋白的分布相符，但乙醇濁度法和冷凍法所沉淀蛋白的種類和組成都與自然沉淀蛋白有較大差異，因此，這兩種方法不能準(zhǔn)確反映黃酒的非生物穩(wěn)定性，而冷熱循環(huán)法和熱處理兩種方法所沉淀蛋白質(zhì)與混濁蛋白分布一致，可以用于預(yù)測(cè)黃酒的非生物穩(wěn)定性。

2.2 黃酒蛋白非生物穩(wěn)定性相關(guān)指標(biāo)與不同預(yù)測(cè)方法相關(guān)性分析結(jié)果

黃酒在存儲(chǔ)過(guò)程中發(fā)生蛋白質(zhì)混濁，從而影響黃酒的外觀和銷售，黃酒中的一些成分與蛋白質(zhì)混濁相關(guān)，例如一些蛋白類、多酚類和金屬離子。為了更好地預(yù)測(cè)黃酒蛋白混濁情況，本研究通過(guò)對(duì)各黃酒樣品的蛋白質(zhì)混濁相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并且采用冷熱循環(huán)法和熱處理法快速反映黃酒的非生物穩(wěn)定性，分析各項(xiàng)混濁指標(biāo)與非生物穩(wěn)定性的關(guān)系。

2.2.1 黃酒樣品蛋白類混濁指標(biāo)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

選取20 種不同產(chǎn)地、不同類型的黃酒樣品，測(cè)定其在生產(chǎn)日期1 個(gè)月內(nèi)的各項(xiàng)蛋白質(zhì)混濁相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2、3；各項(xiàng)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)性描述結(jié)果見(jiàn)表4。

表 2 黃酒樣品的敏感蛋白、總氮及隆丁分區(qū)Table 2 Concentrations of sensitive protein and total nitrogen and Lundin composition in Chinese yellow wine

表 3 黃酒樣品多酚類指標(biāo)、鐵離子及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果Table 3 Concentrations of polyphenols and iron ions and stability evaluation of Chinese yellow wine

表 4 黃酒樣品蛋白質(zhì)混濁相關(guān)理化指標(biāo)及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)性描述Table 4 Statistical description of physicochemical indexes related to turbidity and stability of Chinese yellow wine

2.2.2 黃酒樣品蛋白類混濁指標(biāo)與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)性分析結(jié)果

將購(gòu)買的每一種黃酒分成兩份，一份用于測(cè)定蛋白混濁相關(guān)指標(biāo)及其初始濁度，并且進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，另一份存放于自然條件下，定時(shí)測(cè)定其濁度并觀察混濁情況。利用SPSS 18.0軟件對(duì)測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果和自然存放后的濁度進(jìn)行分析，以期建立更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)黃酒非生物穩(wěn)定性的方法。

采用SPSS 18.0軟件對(duì)20 種黃酒的蛋白類混濁指標(biāo)與不同穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。從表5可以看出，與冷熱循環(huán)法相關(guān)性最顯著的蛋白類混濁指標(biāo)為中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度，呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.647，P＜0.01），其次為中分子質(zhì)量氮占總氮的比例（B區(qū)比例）（r＝-0.559，P＜0.05）和敏感蛋白含量（r＝-0.477，P＜0.05），均呈現(xiàn)為顯著負(fù)相關(guān)；對(duì)黃酒樣品的熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相關(guān)性最顯著的蛋白類指標(biāo)同樣也是中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度，呈極顯著正相關(guān)（r＝0.694，P＜0.01），另外與總氮質(zhì)量濃度呈極顯著正相關(guān)（r＝0.691，P＜0.01），其次為低分子質(zhì)量氮比例（C區(qū)比例）和低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度（r＝-0.645，P＜0.01；r＝0.632，P＜0.01）。

由表5可知，冷熱循環(huán)法與中分子質(zhì)量氮相關(guān)指標(biāo)和敏感蛋白含量顯著相關(guān)，而熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)法與總氮質(zhì)量濃度、高分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度、中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度、低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度、C區(qū)比例等眾多指標(biāo)顯著相關(guān)?；鞚岬鞍椎姆肿淤|(zhì)量分布在13～56 kDa，屬于中分子質(zhì)量氮（12～60 kDa）[26]。酒體中的大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)發(fā)酵、壓濾、澄清和煎酒過(guò)程，絕大多數(shù)已被去除，中、低分子質(zhì)量的蛋白在受到外界環(huán)境影響時(shí)，是形成混濁的主要原因[4]。因此，冷熱循環(huán)法能更準(zhǔn)確地反映黃酒的非生物穩(wěn)定性，并且中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度與其顯著相關(guān)，可以用于黃酒非生物穩(wěn)定性預(yù)測(cè)模型的建立。

表 6 黃酒樣品蛋白質(zhì)混濁相關(guān)多酚類、鐵離子及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析Table 6 Correlation between turbidity-related polyphenols, iron ions and stability of Chinese yellow wine

從表6中可發(fā)現(xiàn)，?4 NTU循環(huán)數(shù)與多酚類指標(biāo)和鐵離子質(zhì)量濃度的相關(guān)性不顯著，熱穩(wěn)定性與總酚質(zhì)量濃度和敏感多酚濁度有一定的相關(guān)性。

2.3 自然存放酒樣混濁情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果

將購(gòu)買的20 種酒樣存放于自然條件下，定期觀察其混濁情況并測(cè)定濁度，從生產(chǎn)日期開(kāi)始計(jì)算至自然存放9 個(gè)月的和12 個(gè)月的濁度及混濁情況如表7所示。在存放的過(guò)程中，黃酒的濁度越來(lái)越大，混濁程度越來(lái)越嚴(yán)重。對(duì)樣品的混濁情況分布進(jìn)行分析（圖2），存放9 個(gè)月時(shí)，約30%的樣品出現(xiàn)嚴(yán)重混濁，存放到12 個(gè)月時(shí)，50%的樣品出現(xiàn)嚴(yán)重混濁，在瓶底形成一層沉淀，嚴(yán)重影響外觀品質(zhì)。

表 7 自然存放不同時(shí)間黃酒的混濁情況Table 7 Change in turbidity of Chinese yellow wine during ambient storage

圖 2 黃酒混濁情況頻數(shù)分布圖Fig. 2 Turbidity distribution of Chinese yellow wine during ambient storage

在本研究中，將黃酒混濁程度共分為4 個(gè)等級(jí)：無(wú)混濁、輕微混濁、中等混濁及嚴(yán)重混濁。為了更好地將濁度與混濁情況對(duì)應(yīng)起來(lái)，對(duì)表7中酒樣的濁度與混濁情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分分類，結(jié)果見(jiàn)表8。

表 8 黃酒混濁程度分類Table 8 Turbidity rating of Chinese yellow wine

2.4 黃酒非生物穩(wěn)定性預(yù)測(cè)方法的建立

2.4.1 黃酒樣品濁度與各項(xiàng)混濁指標(biāo)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析結(jié)果

黃酒在存放的過(guò)程中除了受到溫度變化、振動(dòng)、光照和氧化等因素影響外，酒體成分中的混濁相關(guān)物質(zhì)也會(huì)影響黃酒的濁度變化。將20 種酒樣自然存放9 個(gè)月和12 個(gè)月的濁度與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)及各項(xiàng)蛋白混濁指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如表9～11所示。

表 9 自然存放酒樣濁度與穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)相關(guān)性分析Table 9 Correlation analysis between stability and turbidity of Chinese yellow wine

從表9中可以看出，自然存放9、12 個(gè)月酒樣的濁度與冷熱循環(huán)法?4 NTU循環(huán)數(shù)極顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.678，P＜0.01；r＝-0.688，P＜0.01），而與熱穩(wěn)定性相關(guān)性不顯著。因此，?4 NTU循環(huán)數(shù)可以用于非生物穩(wěn)定性預(yù)測(cè)模型的建立。

表 10 自然存放酒樣濁度與蛋白類混濁指標(biāo)相關(guān)性分析Table 10 Correlation analysis between protein and nitrogen indexes and turbidity of Chinese yellow wine stored under ambient conditions

根據(jù)表10可知，黃酒樣品存放9 個(gè)月濁度與敏感蛋白含量、總氮質(zhì)量濃度、低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度呈顯著相關(guān)，存放12 個(gè)月濁度與敏感蛋白含量、總氮質(zhì)量濃度、中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度和低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度顯著正相關(guān)，因此敏感蛋白含量、總氮質(zhì)量濃度、中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度和低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度也能夠用于非生物穩(wěn)定性預(yù)測(cè)模型的建立。

表 11 自然存放酒樣濁度與初始濁度、多酚類指標(biāo)和鐵離子含量相關(guān)性分析Table 11 Correlation analysis between initial turbidity, polyphenols contents and iron ion content and turbidity of Chinese yellow wine stored under ambient conditions

從表11可知，黃酒樣品分別存放9 個(gè)月和12個(gè)月后的濁度與樣品的初始濁度相關(guān)性并不顯著，因此不能根據(jù)初始濁度來(lái)判斷黃酒的非生物穩(wěn)定性，并且其與多酚類指標(biāo)和鐵離子質(zhì)量濃度的相關(guān)性也不顯著，因此不用于預(yù)測(cè)模型的建立。

2.4.2 黃酒非生物穩(wěn)定性多元回歸預(yù)測(cè)模型的建立

通過(guò)對(duì)黃酒樣品自然存放濁度與各蛋白質(zhì)混濁相關(guān)指標(biāo)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，選取與自然存放酒樣濁度顯著相關(guān)的指標(biāo)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)方法，利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，建立預(yù)測(cè)黃酒自然存放12 個(gè)月后濁度的模型，模型分析結(jié)果如表12所示。模型的相關(guān)系數(shù)0.805，決定系數(shù)R2為0.648。模型的F檢驗(yàn)值為5.155，P值為0.007，達(dá)到極顯著水平，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的要求。

表 12 模型的方差分析Table 12 Analysis of variance of the regression model

根據(jù)上文對(duì)自然存放9、12 個(gè)月濁度與各蛋白質(zhì)混濁相關(guān)指標(biāo)和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)之間的相關(guān)性分析，選取與濁度顯著相關(guān)的?4 NTU循環(huán)數(shù)、敏感蛋白含量、總氮質(zhì)量濃度、低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度、中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度為模型自變量，以存放12 個(gè)月的濁度為因變量，建立多元線性回歸方程，預(yù)測(cè)存放12 個(gè)月后黃酒的濁度，模型的相關(guān)參數(shù)如表13所示。最終模型的回歸方程如下式所示。

Y1＝2.79-0.485X1+0.663X2+0.327X3+1.577X4-3.864X5

式中：Y1為自然存放12 個(gè)月濁度/NTU；X1為?4 NTU循環(huán)數(shù)；X2為敏感蛋白含量/NTU；X3為總氮質(zhì)量濃度/（g/L）；X4為低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度/（g/L）；X5為中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度/（g/L）。

表 13 建立模型的回歸參數(shù)分析Table 13 Coefficient analysis of the regression model

將各參數(shù)代入模型給出的回歸方程，計(jì)算出黃酒存放12 個(gè)月濁度預(yù)測(cè)值，與實(shí)際測(cè)得的濁度值進(jìn)行比較分析，驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度。從圖3可以發(fā)現(xiàn)，黃酒存放12 個(gè)月的濁度預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值具有較好的對(duì)應(yīng)性，除少數(shù)樣品外，均位于直線y＝x附近。因此，該模型可用于預(yù)測(cè)黃酒存放12 個(gè)月后的濁度。了解黃酒存放12 個(gè)月后的混濁情況，有助于提前發(fā)現(xiàn)非生物穩(wěn)定性差的黃酒，避免其流入市場(chǎng)，對(duì)于黃酒生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)和銷售的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

圖 3 存放12 個(gè)月濁度實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值偏差Fig. 3 Deviation between actual values and model predicted values of turbidity after 12 months of storage

3 結(jié) 論

通過(guò)分析20 種不同產(chǎn)地、不同類型黃酒樣品的混濁相關(guān)指標(biāo)、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)與黃酒自然存放后樣品濁度之間的相關(guān)性，利用SPSS 18.0軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，發(fā)現(xiàn)瓶裝黃酒濁度與增加4 NTU所需冷熱處理循環(huán)數(shù)、敏感蛋白含量、總氮質(zhì)量濃度、低分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度和中分子質(zhì)量氮質(zhì)量濃度等指標(biāo)顯著相關(guān)，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了它們之間的多元線性回歸方程。該方程用于黃酒預(yù)測(cè)非生物穩(wěn)定性的結(jié)果表明，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值具有較好的對(duì)應(yīng)性，采用該模型預(yù)測(cè)黃酒存放12 個(gè)月后的濁度，有助于提前發(fā)現(xiàn)非生物穩(wěn)定性差的黃酒，避免其流入市場(chǎng)，對(duì)于黃酒生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)和銷售的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。