徐冬梅，李亞英，李玉靜

（1.石家莊職業(yè)技術(shù)學院食品與藥品工程系，河北石家莊050081；2.河北科技大學，河北石家莊050018；3.河北交通職業(yè)技術(shù)學院，河北石家莊050051）

呋喃西林（Nitrofurazone）是硝基呋喃類藥物的一種，具有5-硝基呋喃母核[1]，可抑制細菌DNA 和RNA合成，干擾菌體內(nèi)酶代謝系統(tǒng)，能有效殺滅多種革蘭氏陰性和陽性菌及某些真菌和原蟲，曾被廣泛應用于畜牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖中[2]。然而，該類藥物及其代謝物具有細胞誘變性、動物致癌毒性[3]，通過食物鏈進入人體后會產(chǎn)生潛在危害，大部分國家已經(jīng)禁止其在肉食中殘留[4]。

呋喃西林在動物體內(nèi)會被迅速代謝[5]，不易檢測，其代謝產(chǎn)物氨基脲（semicarbazide hydrochloride，SEM）能跟細胞內(nèi)蛋白長期結(jié)合[6-8]，存留較長時間，因此SEM 可作為呋喃西林殘留的標識物。目前，呋喃西林代謝物的檢測方法主要為色譜分析技術(shù)和免疫學分析技術(shù)。色譜技術(shù)主要為高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-mass，LC-MS）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）等，這些方法能隨刻進行精確檢測[9-11]，有著靈敏和準確等優(yōu)點，但儀器設備昂貴、操作繁瑣、檢測成本高，不適合現(xiàn)場批量檢測，嚴重影響了對其非法使用的檢測監(jiān)管和風險預警。以酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)為代表的免疫分析方法具有靈敏準確、方便快捷、分析容量大、檢測成本低等優(yōu)點，可以實現(xiàn)對目標物進行現(xiàn)場批量快速定性定量分析，已成為目前最有效的初篩技術(shù)手段[12-17]，廣泛應用于動物源性食品中有毒有害物質(zhì)的檢測。

本研究以自制的SEM 抗原、抗體為基礎(chǔ)原料[18]，通過確定抗原和抗體使用濃度、抗原包被時間和溫度、一抗和二抗作用時間等反應條件，建立間接競爭ELISA 檢測方法，通過性能測定，該方法的靈敏度、準確度和精密度等參數(shù)均符合我國動物源性食品中獸藥殘留檢測方法的有關(guān)規(guī)定，具有簡便、快速、能批量檢測等特點，能夠應用于動物源性食品中呋喃西林代謝物的檢測。影響該方法性能的因素有很多，如人工抗原的純度、抗體的敏感性和特異性以及方法學的各項反應條件等[19-23]。本試驗采用了自制的呋喃西林代謝物的人工抗原和單克隆抗體，人工抗原經(jīng)透析等手段保證了純度，單克隆抗體經(jīng)鑒定具有很高的敏感性和特異性，從基礎(chǔ)材料上有效保障了方法學的建立。通過進一步的試驗，建立其酶聯(lián)免疫吸附測定方法。

1 材料與方法

1.1 試劑

呋喃西林代謝物標準品：Sigma 公司；呋喃西林代謝物完全抗原SEM-OVA、呋喃西林代謝物單克隆抗體細胞株3D9：河北省科學院生物研究所細胞生化研究室研制；牛血清白蛋白（bovine serum albumen，BSA）、卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、胎牛血清：上海生物工程股份有限公司；HRP 標記山羊抗小鼠IgG：北京中杉金橋生物；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設備

MULTIVAP 型氮吹儀：上海書俊儀器設備有限公司；ME54E 電子分析天平：METTLER 公司；液氮罐：成都金鳳液氮容器有限公司；Allegra X-15R 高速冷凍離心機：德國BECKMAN 公司；DKB-8A 電熱恒溫水浴鍋：上海精宏設備有限公司；ELX800 酶標儀：美國伯騰儀器有限公司Bio-TEK；XW-80A 漩渦混合器：上海醫(yī)科大學儀器廠；96 孔酶標板：Costar 公司；微量移液器：Eppendorf 公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA 檢測方法條件優(yōu)化

1.3.1.1 抗原抗體工作濃度的確定

抗原、抗體采用方陣稀釋法，橫向包被梯度濃度的抗原，縱向加入倍比稀釋的抗體，用間接酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）法進行測定，選擇A450nm為1.0 左右時抗原和抗體濃度的組合作為理想工作濃度。

1.3.1.2 抗原包被時間及溫度的選擇

以確定的抗原、抗體濃度，分別設定包被條件為以下 6 種：4 ℃包被過夜、37 ℃孵育 0.5、1、2、3 h 和 4 h，分別檢測其吸光度值，選擇最佳包被時間和溫度。

1.3.1.3 一抗作用時間的選擇

一抗作用時間會影響到一抗和抗原的反應效果，因此需要通過試驗來確定一抗與抗原的最佳作用時間。本試驗選用一抗作用時間分別為10、20、30、45 min和60 min，通過線性關(guān)系選擇最佳作用時間。

1.3.1.4 羊抗小鼠二抗作用時間的確定

羊抗小鼠二抗的孵育時間選用10、20、30、45 min和60 min 進行測定。

1.3.2 樣品預處理

準確稱取（1±0.05）g 均質(zhì)樣本于 50 mL 離心管中；加入4 mL 去離子水，0.5 mL 1 mol/L 鹽酸溶液和100 μL 衍生化試劑工作液，充分振蕩；在37 ℃過夜孵育（約16 h）或60 ℃水浴孵育 1.5 h；分別加入 5 mL 0.1 mol/L K2HPO4溶液，0.4 mL 1 mol/L NaOH 溶液和6 mL 的乙酸乙酯，充分振蕩5 min；室溫26 ℃下4 000 r/min，離心10 min；取出3 mL 的上層液到另一5 mL 離心管中，50 ℃～60 ℃水浴氮氣吹干；用 2 mL 正已烷溶解殘留物，再加入1 mL 復溶工作液充分振蕩混合 30 s；室溫 26 ℃ 4 000 r/min，離心 5 min；去除上層正己烷相以及兩相（正己烷相和水相）之間的泡沫或者膠狀物，取下層水相50 μL 樣品進行檢測。

1.3.3 ELISA 方法的性能測定

1.3.3.1 標準曲線的建立

按照優(yōu)化的條件，在線性范圍內(nèi)繪制標準曲線，計算回歸方程和R2，計算IC50值；重復測定，確定標準曲線的穩(wěn)定性。

1.3.3.2 檢測限測定

根據(jù)歐盟《動物源性食品中獸藥殘留檢測方法》的規(guī)定，分別測定20 份魚肉組織的空白樣品，根據(jù)以上所述的方法對樣品進行處理。用回歸方程計算樣品殘留濃度，用SPSS 得出樣品濃度的平均值（X）和標準差（SD），以X 加3 倍SD 值作為各樣本的最低檢測限。

1.3.3.3 準確度試驗

采用樣品添加回收試驗檢測該方法的準確度，在空白魚肉樣品中添加不同濃度的待測物，用間接競爭ELISA 方法檢測?；厥章视嬎闳缦拢?/p>

回收率/%=實測濃度（μg/L）/添加濃度（μg/L）×100

1.3.3.4 精密度試驗

精密度試驗用變異系數(shù)來表示。

某日經(jīng)過一家普通餐廳，便有心進去進餐。當他走進洗手間時，發(fā)現(xiàn)一張老舊卻別致的桌子上放著一瓶鮮艷盛開的花，洗手間內(nèi)干凈整潔，一塵不染。他發(fā)現(xiàn)很多人洗手后會主動把臺子擦干凈。老板剛好進來，他便對老板說：“這花真漂亮！”老板得意地說：“知道嗎？我在此擺鮮花已十余年了，你絕對想不到它為我省去多少清潔工作?！?/p>

式中：SD 表示標準偏差；X 表示平均值。

取5 個批次的組裝試劑盒，測定魚肉組織中添加不同濃度的待測物的變異系數(shù)。

1.3.3.5 ELISA 法與儀器方法的比較

選取魚肉樣本，用本試驗確定的間接競爭ELISA法和農(nóng)業(yè)部783 號公告-1-2006 中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）同時對樣品進行檢測，比較兩種方法的符合性。

2 結(jié)果分析

2.1 抗原抗體最佳工作濃度的確定

對抗原抗體的最佳工作濃度的進行測定，結(jié)果如圖1。

圖1 SEM 不同抗原抗體濃度檢測結(jié)果Fig.1 Different antigen antibody concentration detection results of SEM

隨著包被濃度的降低，抑制曲線在上移，IC50值在上升，可能是抗原抗體的結(jié)合能力較差，需要比較高的作用濃度。綜合考慮，選擇線性較好的抗原濃度1 μg/mL、抗體稀釋倍數(shù) 1 ∶1 萬作為 SEM 的 ELISA 法最佳抗原抗體使用濃度。

2.2 包被時間及溫度的確定

包被條件結(jié)果見圖2。

圖2 最佳包被時間和溫度的確定Fig.2 Determination of optimal packet time and temperature

結(jié)果表明，37 ℃ 0.5 h 所得 OD 值明顯較低，到37 ℃2 h 后OD 值趨于穩(wěn)定，且與4 ℃過夜的OD 值無明顯差別，故確定37 ℃2 h 或4 ℃過夜為最佳包被條件。

2.3 一抗作用時間的優(yōu)化

隨著抗體和抗原作用時間的增加，抑制曲線呈上移趨勢，綜合反應時間和線性關(guān)系因素，選擇30 min作為SEM 間接競爭ELISA 的一抗作用時間。

2.4 羊抗小鼠二抗作用時間的確定

對二抗作用的時間進行測定，結(jié)果如圖4。

圖3 SEM 不同的一抗作用時間結(jié)果Fig.3 Results of different action time of primary antibody

圖4 SEM 不同的二抗作用時間結(jié)果Fig.4 Results of different action time of secondary antibody

隨著作用時間的延長抑制曲線呈現(xiàn)上移，且線性范圍在擴大，綜合反應時間和線性關(guān)系，選擇30 min作為SEM 間接競爭ELISA 的二抗作用時間。

2.5 標準曲線

將 6 個濃度的 SEM 標準溶液（0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43 μg/L），每個濃度重復 5 孔，按照間接競爭ELISA 法測定獲得相應的吸光度值，計算抑制率B/B0（B0為標準品 0 μg/L 的吸光度值，B 為標準品不同濃度的吸光度值）。以B/B0為縱坐標，以標準品濃度的對數(shù)值為橫坐標，繪制SEM 的抑制曲線。結(jié)果如圖5。

圖5 SEM ELISA 試劑盒標準曲線Fig.5 ELISA kit standard curve of SEM

SEM 的 ELISA 檢測方法在 0.03 μg/L～2.43 μg/L范圍內(nèi)呈線性，線性方程為y=-0.335 1x+0.384 2（R2=0.992 7）。以線性最低點0.03 μg/L 作為該檢測方法靈敏度。

2.6 檢測限測定

對魚肉組織、蝦肉組織樣本進行檢測，結(jié)果如表1和表2 所示。

表1 魚肉組織樣本測定結(jié)果Table 1 Determination of fish tissue samples μg/kg

表2 蝦肉組織樣本測定結(jié)果Table 2 Determination of tissue samples from shrimp meat μg/kg

檢測限分別為 0.236 μg/kg 和 0.229 μg/kg，根據(jù)實際檢測情況將樣本的最低檢測限定為0.25 μg/kg。

2.7 試劑盒準確度及精密度測定

SEM 的ELISA 試劑盒測定魚肉組織中添加回收試驗，結(jié)果如表3 所示，樣品回收率均在75%～120%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在15%以下，符合我國動物源食品中獸藥殘留檢測方法的規(guī)定。

2.8 與儀器方法的對比試驗

本試驗用標準方法LC-MS/MS 和ELISA 方法同時測定樣品中SEM 的含量見圖6。兩種方法用于魚肉樣本的檢測，均呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，R2為0.994 4。

表3 樣品的變異系數(shù)及回收率Table 3 Coefficient of variation and recovery of samples

圖6 LC-MS/MS 和ELISA 方法檢測魚肉樣本中SEM 的相關(guān)性比較Fig.6 Correlation comparison between LC-MS/MS and SEM in fish samples

3 結(jié)論

本研究建立的檢測方法在 0.03 μg/L～2.43 μg/L 范圍內(nèi)呈線性，線性方程為y=-0.335 1x+0.384 2（R2=0.9927），檢測靈敏度為 0.03 μg/kg，魚肉組織樣本、蝦肉組織樣本的檢測限分別為0.236、0.229 μg/kg，回收率均在75%～120%之間，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均在15 %以下，通過與標準方法LC-MS/MS 對比驗證，兩種方法用于魚肉樣本的檢測均呈現(xiàn)較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.994 4。本研究建立的呋喃西林代謝物酶聯(lián)免疫吸附測定方法的靈敏度、準確度和精密度等參數(shù)均符合我國動物源性食品中獸藥殘留檢測方法的規(guī)定，具有靈敏準確、方便快捷、分析容量大、檢測成本低等優(yōu)點，適合動物源性食品中呋喃西林代謝物的檢測。