張 季 鄒陳蔚 倉 慧 高 昳 徐依人 潘 虹 劉鵬飛&

徐州醫(yī)科大學(xué)江陰臨床學(xué)院消化內(nèi)科1(214400) 南通大學(xué)附屬江陰醫(yī)院消化內(nèi)科2

背景：食管癌是全球癌癥死亡的主要原因之一。研究表明，T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim-3)可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，與多種惡性腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后不良密切相關(guān)。目的：研究Tim-3在食管癌變過程中的表達(dá)并探討其臨床意義。方法：收集103例食管癌、21例食管高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、16例食管低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變和20例食管慢性炎組織的病理蠟塊，采用免疫組化方法檢測(cè)Tim-3表達(dá)；分析Tim-3表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果：從食管慢性炎、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變至食管癌組織，Tim-3表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)(0.271±0.138、0.368±0.198、0.443±0.147、0.639±0.119, P<0.05)。Tim-3表達(dá)與食管癌浸潤程度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡和腫瘤部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：Tim-3在食管癌變過程中表達(dá)升高，食管癌組織中Tim-3過表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。Tim-3可能成為評(píng)估食管癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。

食管癌是在全世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，根據(jù)GLOBOCAN 2018數(shù)據(jù)，全球食管癌年新發(fā)病例數(shù)約為57.2萬，占全球新發(fā)癌癥病例總數(shù)的3.16%，年死亡病例數(shù)約為50.86萬，占全球癌癥死亡病例總數(shù)的5.32%[1]。早期食管癌癥狀多不明顯，甚至沒有任何癥狀，待出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難癥狀時(shí)，腫瘤多已進(jìn)展至中晚期，常伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或周圍組織浸潤，給后續(xù)治療帶來極大的挑戰(zhàn)。

T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是機(jī)體抗腫瘤免疫的基礎(chǔ)。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3, Tim-3)為Tim家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白，最早被認(rèn)為是一類特異性表達(dá)于分化成熟的Th1細(xì)胞表面的抑制性分子[2]。作為一種免疫檢查點(diǎn)分子，Tim-3可介導(dǎo)T細(xì)胞失能和耗竭，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、侵襲和轉(zhuǎn)移，從而影響患者預(yù)后和轉(zhuǎn)歸[3-4]。關(guān)于Tim-3與惡性腫瘤的一系列研究發(fā)現(xiàn)，Tim-3高表達(dá)于多種惡性腫瘤患者的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞甚至外周血中，包括非小細(xì)胞肺癌[5]、胃癌[6]、肝細(xì)胞癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、骨肉瘤[9]、宮頸癌[10]、乳腺癌[11]等，并與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良密切相關(guān)，被認(rèn)為是一種新的腫瘤標(biāo)志物和潛在的腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)Tim-3在食管癌變過程中不同病變階段的表達(dá)，分析其表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系，以期為食管癌的診治和預(yù)后判斷提供新的思路和依據(jù)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

連續(xù)收集徐州醫(yī)科大學(xué)江陰臨床學(xué)院2012—2020年經(jīng)手術(shù)標(biāo)本病理或內(nèi)鏡活檢病理診斷為食管癌或食管上皮內(nèi)瘤變的患者，所有患者均未接受放療、化療或免疫靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重外傷手術(shù)患者；②系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾??；③嚴(yán)重肝腎功能不全；④其他器官系統(tǒng)惡性腫瘤或癌前病變；⑤病例資料不完整。選取同期經(jīng)內(nèi)鏡活檢病理診斷為食管慢性炎的患者20例作為對(duì)照組。研究方案通過徐州醫(yī)科大學(xué)江陰臨床學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，入選病例對(duì)標(biāo)本和病例資料的使用知情同意。

二、Tim-3表達(dá)檢測(cè)

取得入選病例的病理蠟塊，采用免疫組化PV二步法(PV-9001兔二步法檢測(cè)試劑盒，二抗為增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔IgG聚合物，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)Tim-3(Tim-3兔多克隆抗體，Abcam plc.)表達(dá)。細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為Tim-3表達(dá)陽性。使用ImageJ軟件分析Tim-3表達(dá)的積分光密度值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般資料

共103例食管癌患者和37例食管上皮內(nèi)瘤變患者納入研究，低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變16例，高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變21例。參照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)發(fā)布的第8版食管和食管胃交界部癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)[12]，103例食管癌患者中TNM Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為34例、29例、19例和21例。20例食管慢性炎患者中標(biāo)本源自食管上段2例，中段5例，下段13例。四組間性別構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.224,P=0.011)，年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=7.172,P=0.067；表1)。

表1 不同食管病變患者一般資料比較

二、Tim-3在食管癌組織中過表達(dá)

免疫組化染色顯示，各食管病變組織中均可見Tim-3表達(dá)，食管癌組織中陽性染色細(xì)胞主要是腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，陽性顆粒主要定位于細(xì)胞質(zhì)。各組Tim-3表達(dá)的積分光密度值分析顯示，從食管慢性炎、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變至食管癌組織，Tim-3表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.271±0.138、0.368±0.198、0.443±0.147、0.639±0.119,F=57.609,P<0.001；圖1)。進(jìn)一步的兩兩比較顯示，食管癌組織中的Tim-3表達(dá)水平與食管慢性炎和低級(jí)別、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：食管慢性炎；B：食管低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；C：食管高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變；D：食管癌

三、Tim-3表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)不同臨床參數(shù)將食管癌患者分組，組間Tim-3表達(dá)比較見表2。分析顯示，腫瘤浸潤程度為T3-4期(癌癥侵犯食管纖維膜至食管周圍結(jié)構(gòu))的患者Tim-3表達(dá)水平高于腫瘤浸潤程度為T1-2期(癌癥侵犯黏膜固有層、黏膜肌層、黏膜下層至肌層)的患者，有區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者Tim-3表達(dá)水平高于無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，TNM Ⅲ-Ⅳ期患者Tim-3表達(dá)水平高于TNM Ⅰ-Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同性別、年齡、腫瘤部位分組間Tim-3表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 食管癌組織Tim-3表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系

討 論

腫瘤免疫微環(huán)境(tumor immune microenvironment)在腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，其中包含腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)等多種免疫細(xì)胞，免疫抑制是腫瘤免疫微環(huán)境的主要特征之一[13]。Tim-3是新近鑒定的免疫檢查點(diǎn)分子，起有負(fù)性調(diào)控機(jī)體免疫功能的作用，可表達(dá)于Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，甚至NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞以及多種實(shí)體瘤細(xì)胞表面。Tim-3在免疫細(xì)胞和腫瘤免疫微環(huán)境中高表達(dá)，阻礙免疫活性細(xì)胞增殖、活化并誘導(dǎo)其凋亡，從而使腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)免疫逃逸現(xiàn)象，與腫瘤臨床分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。在效應(yīng)T細(xì)胞(如Th1細(xì)胞)中，Tim-3與其配體半乳凝素-9(galectin-9)結(jié)合可誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡和增殖抑制；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給予galectin-9可致產(chǎn)生干擾素-γ(IFN-γ)的細(xì)胞選擇性缺失，T細(xì)胞免疫功能受抑[14]。癌胚抗原細(xì)胞黏附分子1(CEACAM1)是Tim-3的另一個(gè)配體分子，活化T細(xì)胞表面的Tim-3與CEACAM1共表達(dá)并形成異二聚體，發(fā)揮免疫抑制功能，造成T細(xì)胞耗竭和免疫耐受；在小鼠結(jié)直腸癌模型中，阻斷Tim-3和CEACAM1表達(dá)可增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的消除[15]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Tim-3及其配體在包括食管癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中呈過表達(dá)，腫瘤患者外周血中也可檢測(cè)到Tim-3陽性細(xì)胞比例增高，高表達(dá)的Tim-3與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為以及腫瘤臨床分期較晚和患者預(yù)后不良密切相關(guān)[5-11,16]。

Zheng等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中浸潤的NK細(xì)胞Tim-3表達(dá)顯著上調(diào)，并呈現(xiàn)功能障礙表型，腫瘤浸潤NK細(xì)胞Tim-3高表達(dá)與腫瘤侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及較晚的臨床分期相關(guān)。由此推測(cè)Tim-3與食管癌進(jìn)展密切相關(guān)，可能成為腫瘤進(jìn)展的評(píng)估指標(biāo)。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)Tim-3在食管癌變過程中不同病變階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)從食管慢性炎、低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變、高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變至食管癌，Tim-3表達(dá)呈上升趨勢(shì)。進(jìn)一步分析Tim-3表達(dá)與食管癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示其表達(dá)與腫瘤局部浸潤程度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈顯著正相關(guān)，T3-4期、N1期和TNM Ⅲ-Ⅳ期食管癌患者腫瘤組織中的Tim-3表達(dá)水平顯著高于T1-2期、N0期和TNM Ⅰ-Ⅱ期患者。Tim-3表達(dá)與患者的性別(男、女性)、年齡(中青年和老年)、腫瘤部位(食管上段、中段和下段)無明顯相關(guān)性。上述結(jié)果在Zheng等[16]研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提示Tim-3與食管癌變和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，為食管癌發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后評(píng)估提供了新的臨床思路和依據(jù)。

綜上所述，Tim-3在食管癌變過程中表達(dá)升高，食管癌組織中Tim-3過表達(dá)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)，提示Tim-3可能成為評(píng)估食管癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。本研究的不足之處主要在于未追蹤隨訪入選病例的生存信息以進(jìn)一步分析Tim-3表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，后續(xù)研究擬擴(kuò)大樣本量、采集患者生存信息以彌補(bǔ)此缺陷。