賈一鑫 孟立娜

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(310006)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，早期癥狀不明顯，隨著癌腫的增大可表現(xiàn)為排便習(xí)慣改變、便血、腹瀉、腹瀉與便秘交替、局部腹痛等癥狀，晚期則表現(xiàn)為貧血、體質(zhì)量減輕等全身癥狀。外泌體是一種可由任何類型細(xì)胞釋放的納米級膜性囊泡，內(nèi)含蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等物質(zhì)，其由多囊泡與細(xì)胞膜融合后被釋放至細(xì)胞外。作為一種信號傳遞分子，外泌體可將含有生物信息的內(nèi)容物傳送至靶細(xì)胞，發(fā)揮特定作用。環(huán)狀RNA(circRNA)可穩(wěn)定存在并隨外泌體釋放于血清中。近來，越來越多的研究表明，circRNA與CRC的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后存在密切聯(lián)系。通過檢測血清circRNA對CRC進(jìn)行早期篩查可能具有重要的臨床價值。本文就外泌體circRNA對CRC早期篩查的臨床意義作一綜述。

一、CRC的發(fā)病現(xiàn)狀

在全球范圍內(nèi)，CRC的發(fā)病率居男性腫瘤的第2位，約占10.9%；居女性的第3位，約占9.6%[1]。世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)的研究[2]顯示，2018年全球CRC新發(fā)病例共185.0萬例，約占全球惡性腫瘤的10.2%，為第3位最常見的惡性腫瘤。臨床上對CRC的篩查手段主要為檢測血清腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA19-9、CA50以及結(jié)腸鏡檢查等，但目前血清腫瘤標(biāo)志物檢測CRC的敏感性和特異性均不甚理想。因此亟待探尋一種安全高效、能在人群中普及的CRC早期篩查新方法。目前大量研究[3-8]結(jié)果表明，外泌體circRNA可能在CRC的發(fā)生、發(fā)展、演變、轉(zhuǎn)移等方面起有至關(guān)重要的作用，因此檢測外泌體circRNA有望成為CRC早期篩查的新方法。

二、外泌體的概述

外泌體是一種由多囊泡胞內(nèi)體(multivesicular endosome, MVE)與細(xì)胞膜融合后向胞外分泌的、直徑30～150 nm的小囊泡，可作為“信使”參與細(xì)胞間信息調(diào)控[9]。外泌體可從全身大多數(shù)細(xì)胞脫落，并存在于體液(血液、汗液、尿液、唾液、母乳、腦脊液等)中，提示其可能參與諸多生理或病理過程[10]。研究[11]顯示circRNA在外泌體富集且穩(wěn)定存在，并可隨外泌體出現(xiàn)于血液中。

三、CircRNA的生物學(xué)起源和特性

CircRNA是一類內(nèi)源性非編碼RNA，具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，缺乏傳統(tǒng)線性RNA的5’帽結(jié)構(gòu)和3’多聚腺苷酸尾，長度不一，早前生物學(xué)家普遍認(rèn)為其是剪接錯誤的結(jié)果[12]。隨著高通量測序等技術(shù)的發(fā)展，大量circRNA被發(fā)現(xiàn)，顯示出獨特的生物學(xué)特性，主要包括以下幾個方面：①含量多，種類多。 目前在真核生物和原核生物中均發(fā)現(xiàn)了數(shù)量繁多的circRNA；②高穩(wěn)定性：由于不具有5’帽端和3’尾端的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此可不受核酸外切酶的影響而穩(wěn)定存在[13]；③高保守性：研究[14]發(fā)現(xiàn)人類的某些circRNA與一些昆蟲的circRNA有相似的序列；④高表達(dá)：采用高通量測序發(fā)現(xiàn)，在某些疾病中，部分circRNA大量表達(dá)，甚至可多于線性RNA的表達(dá)[13]。研究[15]表明CRC會分泌大量circRNA進(jìn)入血循環(huán)。上述特性使circRNA有望成為CRC早期篩查的生物學(xué)指標(biāo)。

四、CircRNA的功能

CircRNA與生物的生長發(fā)育、疾病的發(fā)生發(fā)展等密切相關(guān)，并在作為預(yù)測、診斷疾病標(biāo)志物等方面的應(yīng)用前景十分廣闊，但其生物學(xué)功能仍未完全闡明。目前較為明確的circRNA生物學(xué)功能主要包括：①充當(dāng)微小RNA(miRNA)的海綿體：circRNA上存在大量miRNA結(jié)合位點，可通過海綿吸附作用與miRNA 相互結(jié)合，抑制miRNA表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[16]。②轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用：研究[12]發(fā)現(xiàn)，一些circRNA可與RNA聚合酶Ⅱ相互作用，進(jìn)而影響宿主的基因轉(zhuǎn)錄。③調(diào)節(jié)基因表達(dá)：circRNA可與調(diào)節(jié)mRNA的結(jié)合蛋白結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)。④翻譯作用：circRNA雖屬于非編碼RNA，但部分circRNA含有大量編碼鏈，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)翻譯[17]。

五、CircRNA與CRC

近年研究已明確circRNA參與諸多疾病的發(fā)生和發(fā)展，包括心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腫瘤疾病等。其中，circRNA與CRC的關(guān)系備受關(guān)注。

1. CircRNA在CRC中的表達(dá)：Bian等[18]的研究顯示，CRC組織中hsa_circRNA_103809表達(dá)下調(diào)，并促進(jìn)CRC細(xì)胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，敲除該circRNA則可顯著促進(jìn)CRC細(xì)胞的增殖和遷移。作為抑癌因子，hsa_circRNA_103809可能通過miR-532-3P/FOXO4軸參與CRC的生物學(xué)過程。Wang等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000567在CRC組織和CRC細(xì)胞株中的表達(dá)均顯著下調(diào)。Hsa_circ_0000567表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示其可抑制CRC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程。ROC曲線示hsa_circ_0000567診斷CRC的AUC為0.865 3，表明 hsa_circ_0000567對CRC具有較高的敏感性和特異性。Fang等[20]對44例CRC組織及其鄰近非癌組織分析后發(fā)現(xiàn)，circRNA_100290在CRC組織中表達(dá)上調(diào)，且在有轉(zhuǎn)移灶的組織中上調(diào)更為顯著。進(jìn)一步將其沉默后，CRC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著降低，表明circRNA_100290可能參與了CRC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲過程。Guo等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中hsa_circ_0000069高表達(dá)，體外敲除該RNA可明顯誘導(dǎo)CRC細(xì)胞周期阻滯。Xie等[8]在12對匹配的正常和CRC樣本中發(fā)現(xiàn)了85個差異表達(dá)的circRNA，并選擇hsa_circ_001569作為潛在的CRC進(jìn)展調(diào)控因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001569作為miR-145的海綿，通過抑制miR-145的轉(zhuǎn)錄活性，明顯促進(jìn)CRC細(xì)胞增殖和侵襲。上述研究證實circRNA在CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)控作用。

2. 外泌體circRNA診斷CRC：有研究[11]發(fā)現(xiàn)，circRNA在外泌體中富集并隨外泌體出現(xiàn)于血清中，可成為CRC早期篩查的生物學(xué)標(biāo)志物。Lin等[21]的研究結(jié)果顯示，3種circRNA(circ-CCDC66、circ-ABCC1以及circ-STIL)在CRC患者血漿中的表達(dá)均顯著下降。這3個circRNA組合成的3環(huán)RNA集合較單個RNA篩查CRC的特異性、敏感性更高，優(yōu)于傳統(tǒng)的生物蛋白標(biāo)志物。CEA陰性的CRC患者3環(huán)RNA集合的AUC為0.775，對CA19-9陰性CRC患者的AUC為0.778，表明3環(huán)RNA集合可用于早期篩查CEA或CA19-9水平正常的CRC患者。將circRNA集合與CEA和CA19-9結(jié)合可能會使診斷效能進(jìn)一步提高。Yang等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，CRC患者血漿hsa_circ_0002320表達(dá)降低。進(jìn)一步檢測CEA和hsa_circ_0002320預(yù)測CRC的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0002320診斷CRC的敏感性和特異性均優(yōu)于CEA，提示血清外泌體hsa_circ_0002320可能較CEA更合適作為CRC的早期預(yù)測指標(biāo)。Zhou等[23]發(fā)現(xiàn)，在CRC組織中circCAMSAP1表達(dá)豐富，且是上調(diào)最為顯著的circRNA。對20例術(shù)前和術(shù)后CRC患者和9例健康志愿者的血清樣本進(jìn)行微滴式數(shù)字PCR分析后發(fā)現(xiàn)，circCAMSAP1在術(shù)前CRC患者血清中富集，表明circCAMSAP1可作為CRC早期診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。Xie等[24]將TNM Ⅰ/Ⅱ期的CRC患者視為早期CRC患者，通過ROC曲線分析評估血清外泌體circ-PNN對早期CRC和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清外泌體circ-PNN診斷早期CRC的AUC為0.854，但診斷淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能較差(AUC為0.544)，因此外泌體circ-PNN可能更適合作為早期CRC診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。Dou等[25]的研究對3種CRC細(xì)胞株(僅在KRAS突變狀態(tài)上有所不同)和外泌體中的circRNA表達(dá)譜進(jìn)行比較。在細(xì)胞RNA中鑒定了數(shù)百種高質(zhì)量的circRNA候選物，發(fā)現(xiàn)其可轉(zhuǎn)移至外泌體中，且在外泌體中趨于豐富。Hon等[26]的研究顯示，CRC細(xì)胞株和CRC患者血清外泌體中存在circRNA。此外，與KRAS野生型細(xì)胞相比，KRAS突變型細(xì)胞中circRNA富集水平顯著下調(diào)，且在KRAS突變型CRC細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)外泌體circRNA如circFAT1、circARHGAP5以及circHIPK3等差異表達(dá)。另一方面，與健康對照者相比，CRC患者血清外泌體中circRNA的種類不同，CRC患者血清外泌體中部分circRNA缺失，且存在新的circRNA如circ_KLDHC10表達(dá)。Pan等[27]對135例CRC患者、35例良性腸道疾病患者以及45名健康對照者進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0004771表達(dá)在CRC組織中顯著下調(diào)，但CRC患者血清中的外泌體hsa_circ_0004771顯著升高，此差異可能是由circRNA隨外泌體分泌至細(xì)胞外所致。ROC曲線分析顯示，CRC患者循環(huán)外泌體hsa_circ_0004771診斷CRC的AUC為0.92，有助于CRC的鑒別診斷。Ye等[28]的研究對CRC患者與健康對照者的血清外泌體比較后發(fā)現(xiàn)，兩者存在204個差異表達(dá)的circRNA，其中26個在CRC患者血漿外泌體中表達(dá)下調(diào)，178個表達(dá)上調(diào)。其中CRC術(shù)前與術(shù)后hsa_circ_0082182、hsa_circ_0000370相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而hsa_circ_0035445無明顯差異。ROC曲線示hsa_circ_0000370的AUC為0.815 2，hsa_circ_0082182為0.737 1，hsa_circ_0035445為0.702 8，三者聯(lián)合的AUC為0.834 7，且敏感性和特異性較檢測單個RNA高，提示多種circRNA聯(lián)合檢測可提高CRC的早期篩查率。Zhang等[29]對112例CRC患者和46名健康對照者血清外泌體中的circRNA分析后發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0007534表達(dá)存在差異，CRC患者h(yuǎn)sa_circ_0007534呈高表達(dá)，診斷CRC的AUC為0.780，敏感性和特異性分別為0.920和0.522。進(jìn)一步對CRC患者進(jìn)行分期，結(jié)果顯示分期越高，AUC越高，上述結(jié)果提示hsa_circ_0007534不僅可作為CRC早期篩查的生物學(xué)標(biāo)志物，亦能為CRC的臨床分期提供一定參考。Li等[30]的研究對CRC患者血清外泌體中circRNA進(jìn)行meta分析后表明，circRNA表達(dá)失調(diào)是CRC的有效預(yù)測指標(biāo)，AUC為 0.79，加權(quán)敏感性為0.77，特異性為0.67，診斷優(yōu)勢比(diagnostic odds ratio, DOR)為7.52。綜上所述， circRNA在外泌體中富集和穩(wěn)定，可作為CRC早期篩查的生物學(xué)標(biāo)志物。

六、小結(jié)和展望

近年來，circRNA逐漸引起研究者的重視，對circRNA在腫瘤中的生物學(xué)功能和特性的研究取得了顯著進(jìn)展，但仍存在諸多問題未闡明。目前已有研究證實circRNA在CRC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。由于circRNA含量豐富、穩(wěn)定性高、具有疾病特異性等生物學(xué)特征使其有助于CRC早期診斷。未來還需進(jìn)一步研究明確外泌體circRNA與CRC的關(guān)系以及如何篩選對CRC有篩查意義的circRNA。雖然circRNA對CRC早期篩查的研究處于初始階段，但隨著研究的深入以及高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，外泌體circRNA有望成為早期篩查CRC的生物學(xué)指標(biāo)。