張斯?jié)h，黃耿，張新洲，潘富林★

（1.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院腎內(nèi)風(fēng)濕科，廣東 深圳；2.深圳市人民醫(yī)院，廣東 深圳）

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是影響廣大老年患者的常見疾病，隨著我國人口老齡化社會形勢日益嚴(yán)峻，OA帶來的社會影響、經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日趨嚴(yán)重。OA病理表現(xiàn)主要為炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)軟骨破壞，彩超和磁共振可以發(fā)現(xiàn)早期軟骨侵蝕。然而患者此時(shí)并無明顯特異性表現(xiàn)，關(guān)節(jié)平片不能發(fā)現(xiàn)軟骨破壞，臨床往往被忽視，而晚期OA內(nèi)科治療方法，常常需要外科關(guān)節(jié)置換才能改善癥狀。故OA的早期診療非常關(guān)鍵，目前尚無特異性血清學(xué)標(biāo)志物。血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）由凝血酶激活的血小板產(chǎn)生[1]，故被命名血小板反應(yīng)蛋白或凝血酶敏感蛋白。TSP-1家族包括TSP-1、TSP-2、TSP-3、TSP-4、TSP-5[2]，本實(shí)驗(yàn)觀測到TSP-1在OA患者軟骨細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，有望成為OA早期診斷的特異性標(biāo)志物。中藥對骨關(guān)節(jié)炎的作用一直是研究的熱點(diǎn)，復(fù)元膠囊是臨床有效的復(fù)方制劑，在多個(gè)研究中顯示了對OA有肯定的療效。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了TSP-1在OA軟骨細(xì)胞的表達(dá)及復(fù)元膠囊對其抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

TSP-1 ELISA試劑盒 上海晶抗生物有限公司；CD-47 ELISA試劑盒 上海經(jīng)科化學(xué)有限公司；白介素-1β 試劑 Sigma 試劑公司；人源性軟骨細(xì)胞株 上海拜力生物科技公司； ALP ELISA試劑盒、type Ⅹ Collagen ELISA試劑盒、TaKaRa RNA 提取試劑盒、TSP-1多克隆兔抗鼠一抗、TSP-1羊抗兔二抗、GAPDH抗體、DAB顯色試劑盒、Abcam 公司；SAB總蛋白提取試劑盒購自南京萊富賽公司；BCA蛋白檢測試劑盒自廣州威佳生物科技公司；TSP-1、GAPDH引物由深圳華大基因公司合成。

1.1.2 儀器

1.1.3 藥品

復(fù)元膠囊 重慶希爾安藥業(yè)公司生產(chǎn)，僅供試驗(yàn)使用；塞來昔布 輝瑞制藥公司。

SD大鼠12只，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證編號20120001。

1.2 方法

1.2.1 OA細(xì)胞模型造模

軟骨細(xì)胞經(jīng)2次傳代后，取第三代細(xì)胞，加入濃度為10ng/mL的IL-1β，孵育24h，收集培養(yǎng)液，3000rpm離心15分鐘，取上清，按ALP ELISA試劑盒、type Ⅹ Collagen ELISA試劑盒步驟操作，檢測OA軟骨細(xì)胞早期改變標(biāo)志物Ⅹ型膠原、堿性磷酸酶（ALP）[3]。

1.2.2 含藥血清制備

大鼠隨機(jī)分為3組，每組4只。各組大鼠分別予復(fù)元膠囊大、中、小劑量，即 2222.9mg/kg、743.3mg/kg、371.65mg/kg[4]，大鼠每天灌胃2次，正常喂養(yǎng)，連續(xù)5天后，斷頭取血，500×g離心，取上清，置于56℃水浴滅活30min，過0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20℃保存，備用。

1.2.3 分組及給藥

此外，目前大部分研究僅基于臨床療效對阿司匹林的獲益進(jìn)行評價(jià)，而缺乏對于經(jīng)濟(jì)性的考量?；诖?，本研究結(jié)合臨床療效，從經(jīng)濟(jì)性的角度對阿司匹林是否適用于我國全人群CVD一級預(yù)防進(jìn)行藥物經(jīng)濟(jì)學(xué)評價(jià)，以期為相關(guān)臨床實(shí)踐提供參考。

見表1。

各組細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育72小時(shí)，分別收集上清液及軟骨細(xì)胞，備用。

1.2.4 ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液TSP-1 CD-47的表達(dá)

上清液3000rpm離心15分鐘，棄去沉淀，按照TSP-1、CD-47 ELISA試劑盒說明操作，測定各組TSP-1 CD-47相對表達(dá)量，結(jié)果見圖2、圖3。

表1 軟骨細(xì)胞分組及給藥

1.2.5 RT-PCR檢測TSP-1 CD-47 DNA表達(dá)

備用軟骨細(xì)胞加入TRIZOL試劑提取軟骨細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝聚檢驗(yàn)RNA完整性，DEPC水處理RNA后紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度（保持OD260/280在1.8-2.0之間），按照PCR說明書完成mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過在Gene Bank選擇鼠源性TSP-1 CD-47和GAPDH（內(nèi)參）的mRNA的全基因系列，使用軟件設(shè)計(jì)TSP-1 CD-47和GAPDH的引物，TSP-1上游引物，正向：5’ TTCCGGACCGATCCGATTC 3’， 反 向：5’ GACGAGTTCTCTGTTTACCCTGA 3’； GAPDH 上游，正 向 引 物：GTGCTAGCCGCATCTAGTAG 3’，反 向 引 物：5’CGATTGTGCCGTCGAACTTA 3’，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR法擴(kuò)增mRNA，并對產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，結(jié)果見圖4。

1.2.6 Western-blot檢測TSP-1 CD-47蛋白表達(dá)

用RIPA蛋白提取試劑提取總蛋白，按照BCA protein Assay kit步驟定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉 1小時(shí)，分別加入 TSP-1（1：500）CD-47（1：500）和GAPDH（1：2000）一抗，4℃冰箱過夜。羊抗兔二抗室溫孵育30分鐘，ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)成像，結(jié)果見圖5。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0處理，多組之間采用卡方檢驗(yàn)，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，P值小于0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

OA細(xì)胞模型構(gòu)建，見圖1，軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β孵育后，檢測OA早期標(biāo)記物ALP、Ⅹ Collagen，結(jié)果顯示，模型組和陰性對照組上述標(biāo)記物的表達(dá)均有顯著差異，表明造模成功，可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 OA細(xì)胞模型表達(dá)ALP、Collagen10的情況

復(fù)元膠囊含藥血清孵育后，TSP-1在軟骨細(xì)胞上清液表達(dá)的情況見圖2：和空白組比較，TSP-1在模型組（F組）及實(shí)驗(yàn)組（A、B、C組）表達(dá)上調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；和模型組比較，復(fù)元膠囊大、中、小劑量組均能明顯抑制TSP-1的表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，復(fù)元膠囊大劑量組抑制作用最明顯，且大中小劑量組之間體現(xiàn)劑量依賴性。

圖2 復(fù)元膠囊對TSP-1在OA細(xì)胞模型上清液表達(dá)的影響

復(fù)元膠囊含藥血清孵育后CD-47在細(xì)胞上清液表達(dá)情況，見圖3：和空白組比較，CD-47在模型組（F組）及實(shí)驗(yàn)組（A、B、C組）表達(dá)上調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；和模型組比較，復(fù)元膠囊大、中、小劑量組均能明顯抑制CD-47的表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，復(fù)元膠囊大劑量組抑制作用最明顯。

圖3 復(fù)元膠囊對CD47在OA細(xì)胞模型上清液表達(dá)的影響

復(fù)元膠囊干預(yù)后OA細(xì)胞模型后，TSP-1 mRNA表達(dá)情況，見圖4：和空白組比較，TSP-1mRNA在模型組（F組）及實(shí)驗(yàn)組（A、B、C組）表達(dá)上調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；和模型組比較，復(fù)元膠囊大、中、小劑量組均能明顯抑制TSP-1mRNA的表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，復(fù)元膠囊大劑量組抑制作用最明顯，且大中小劑量組之間體現(xiàn)劑量依賴性。

圖4 復(fù)元膠囊對TSP-1 mRNA在OA細(xì)胞模型表達(dá)的影響

復(fù)元膠囊干預(yù)后OA細(xì)胞模型后，TSP-1 蛋白在OA細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，見圖5：和空白組比較，TSP-1蛋白在模型組（F組）及實(shí)驗(yàn)組（A、B、C組）表達(dá)上調(diào)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；和模型組比較，復(fù)元膠囊大、中、小劑量組均能明顯抑制TSP-1蛋白的表達(dá)，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，復(fù)元膠囊大劑量組抑制作用最明顯。

圖5 復(fù)元膠囊對OA細(xì)胞模型表達(dá)TSP-1 蛋白的影響

3 討論

TSP-1在正常組織含量很少，在組織損傷、慢性疾病過程中上調(diào)，除了分布在實(shí)質(zhì)細(xì)胞，還分布在血液[5]、尿液[6]、腦脊液[7]等體液中。在本實(shí)驗(yàn)中檢測到TSP-1在OA細(xì)胞中及細(xì)胞外液均有上調(diào)，證實(shí)OA疾病過程中由軟骨細(xì)胞過表達(dá)TSP-1，且上調(diào)的TSP-1可以進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)。

TSP-1除了在血小板、中性粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞分泌外，在RA[8]、SLE[9]、硬皮病[10]等風(fēng)濕免疫病過程中均有表達(dá)上調(diào)，以及本實(shí)驗(yàn)中在OA軟骨細(xì)胞中明顯表達(dá)增加，證實(shí)TSP-1可以在軟骨細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，在風(fēng)濕性疾病的慢性炎癥過程中發(fā)揮了重要作用。

用IL-1β孵育軟骨細(xì)胞制作OA的細(xì)胞模型，是一種比較多見的試驗(yàn)方法，但是否造模成功，目前仍然沒有可靠的依據(jù)。本研究中采用ELISA方法檢測OA軟骨細(xì)胞早期終端分化的標(biāo)志物ALP及type Ⅹ Collagen，可以衡量造模成功與否，相對于使用電鏡觀察細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)，或者使用免疫組化觀察細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的改變，方法更簡單可行，對于下一步試驗(yàn)具有重要的意義。

CD47為表達(dá)于細(xì)胞表面的膜受體，同時(shí)又是抑制性受體信號調(diào)節(jié)蛋白a的配體，本研究用ELISA法檢測了CD47在軟骨細(xì)胞外液含量增多，不排除膜蛋白的脫落或者其他分泌機(jī)制造成。聯(lián)合檢測TSP-1及其受體CD47，對于早期OA的診斷有很大意義，如果臨床上能抑制TSP-1過度表達(dá)或者抑制其受體CD47的活化，可能對骨關(guān)節(jié)炎的治療有積極的意義。

在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，復(fù)元膠囊均已經(jīng)被證實(shí)對OA有肯定的治療作用，其一，復(fù)元膠囊可以抑制炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放，如抑制 IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF、iNOS 等的釋放[11][12][13]；其二，復(fù)元膠囊抑制軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其增殖[14]；其三，復(fù)元膠囊還可以抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解、抑制基質(zhì)金屬蛋白ADAMTS-4、ADAMTS-5酶的活化[15][16]；TSP-1是 ASAMTS聚糖蛋白酶家族內(nèi)含的系列，本實(shí)驗(yàn)中可以觀察到復(fù)元膠囊可以明顯抑制TSP-1的表達(dá)，且有劑量依賴性，或許可以解釋其保護(hù)OA軟骨基質(zhì)，抑制聚糖蛋白酶ADAMTS的活化，延緩聚糖蛋白被降解的機(jī)制。復(fù)元膠囊是否可以抑制CD47在軟骨細(xì)胞OA模型中mRNA及蛋白表達(dá)，將在后續(xù)研究中繼續(xù)進(jìn)行。