郭兵福，郭勇，洪慧龍,，邱麗娟**

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學(xué)工程，北京 100081；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

明確的插入位點(diǎn)及其旁側(cè)序列是轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)入生物安全評(píng)價(jià)更高階段的必要條件。傳統(tǒng)的插入位點(diǎn)鑒定方法以基于已知外源序列的PCR擴(kuò)增技術(shù)為基礎(chǔ)，主要有TAIL-PCR和Genome walking等。大豆是一個(gè)古四倍體農(nóng)作物，近75%的基因以多拷貝或復(fù)雜拷貝的形式存在，因此，傳統(tǒng)的以PCR為基礎(chǔ)的插入位點(diǎn)鑒定方法在轉(zhuǎn)基因大豆中工作效率并不高。以自主研發(fā)的轉(zhuǎn)G2EPSPS和GAT基因抗草甘膦轉(zhuǎn)化體ZH10-6和GE-J16為研究對(duì)象進(jìn)行重測(cè)序，數(shù)據(jù)過濾后成對(duì)的Pariedend Reads分別拆分為單個(gè)獨(dú)立的Read，每個(gè)Read均單獨(dú)與參考基因組和載體序列進(jìn)行比對(duì)，將一端比對(duì)至載體上，一端比對(duì)至參考基因組上的復(fù)合序列（Junction reads）進(jìn)行富集，根據(jù)富集結(jié)果預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的插入位點(diǎn)，并利用PCR擴(kuò)增測(cè)序和遺傳共分離分析方法對(duì)預(yù)測(cè)的插入位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源T-DNA插入在轉(zhuǎn)化體GE-J16的19號(hào)染色體50543767-50543792位和ZH10-6的17號(hào)染色體7980527-7982541位間，TDNA的整合分別導(dǎo)致了基因組上24 bp和13 bp堿基序列的刪除（圖2）。建立了利用重測(cè)序技術(shù)鑒定大豆插入位點(diǎn)的方法，與前人研究進(jìn)展相比，對(duì)序列比對(duì)方式進(jìn)行了優(yōu)化，由前人研究的Pairedend Reads成對(duì)比對(duì)調(diào)整為單個(gè)Read獨(dú)立比對(duì)的方式，在測(cè)序深度大幅降低的條件下亦能精確鑒定轉(zhuǎn)基因大豆的插入位點(diǎn)及其旁側(cè)序列，為利用重測(cè)序技術(shù)經(jīng)濟(jì)便捷高通量鑒定轉(zhuǎn)基因大豆插入位點(diǎn)提供參考。

圖1 利用重測(cè)序技術(shù)鑒定大豆插入位點(diǎn)技術(shù)流程

圖2 轉(zhuǎn)基因大豆GE-J16（A）和ZH10-6（B）精確插入位點(diǎn)示意圖

(Front.Plant Sci,2016,doi:10.3389/fpls.2016.01009)