韋芳娥

摘要? ? 為了有效提取鹿角靈芝中的主要有效成分，本文研究了提取鹿角靈芝中多糖和三萜等主要活性成分的工藝技術(shù)，建立了靈芝提取生產(chǎn)線，以延長(zhǎng)靈芝的產(chǎn)業(yè)鏈，提高靈芝的附加值，為靈芝有效成分的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞? ? 鹿角靈芝;多糖;三萜;超聲波提取

中圖分類號(hào)? ? R284.2? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2020）03-0217-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

鹿角靈芝（Ganoderma lucidum（Leyss.Ex Fr.）karst）作為靈芝屬的一種，近年來備受重視，在化學(xué)、藥理和臨床等領(lǐng)域均有大量研究。有研究表明，鹿角靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、保肝、抗腫瘤和抗衰老等多種活性[1-3]。鹿角靈芝的主要藥效成分為多糖類和三萜類。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，鹿角靈芝中β-高分子蛋白多糖的含量較普通靈芝高2～5倍，并且含有能激活巨噬細(xì)胞活性，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫力的LPS，干燥品中LPS和β-高分子蛋白多糖的總量高達(dá)43%[2，4]。姜? 旭等[5]研究發(fā)現(xiàn)，鹿角靈芝中含（1-3）-b-D葡糖基的多糖對(duì)ICR小鼠的S180有明顯的抑制作用，其抗腫瘤活性受支鏈數(shù)目、分子量和構(gòu)型的影響;劉研新等[6]通過建立小鼠Lewis肺癌模型，證明鹿角靈芝膠囊在試驗(yàn)小鼠體內(nèi)、體外具有抗腫瘤活性，對(duì)順鉑所造成的腎損傷有拮抗作用。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于鹿角靈芝有效成分提取的研究不多[7-9]。為了有效提取鹿角靈芝中的主要有效成分，本文研究了提取鹿角靈芝中的多糖和三萜等主要活性成分的工藝技術(shù)，以建立提取生產(chǎn)線、延長(zhǎng)產(chǎn)業(yè)鏈、提高附加值，并為鹿角靈芝有效成分的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

1.1.1? ? 試驗(yàn)儀器。TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器責(zé)任有限公司）、101A-2電熱鼓風(fēng)干燥箱（功率4 kW，300 ℃，上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）、CP225D電子天平（d=0.01 mg，德國(guó)賽多利斯股份公司）、KQ5200B超聲波清洗器（40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）、HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）、XW-80A微型旋渦混合儀（上海瀘西分析儀器廠）、DFY-600搖擺式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）、TDL-80-2B低速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、RE52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.1.2? ? 藥品與試劑。鹿角靈芝采自桂林大野領(lǐng)御生物科技有限公司種植基地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院何開家主任藥師鑒定為Ganoderma lucidum（Leyss.Ex Fr.）karst。試劑包括無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)110833-201205，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、齊墩果酸對(duì)照品（批號(hào)100454-200501，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、無水乙醇（分析純，批號(hào)20160913，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、乙醇（分析純，批號(hào)20161111，廣東光輝科技股份有限公司）、濃硫酸（分析純，批號(hào)20120317，廉江市愛廉化試劑有限公司）、蔥酮（化學(xué)純，批號(hào)20130426，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、苯酚（化學(xué)純，批號(hào)20110416，廣州新建精細(xì)化工廠）、香草醛（化學(xué)純，批號(hào)20160722，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、冰乙酸（分析純，批號(hào)20161108，天津福晨化學(xué)試劑廠）、高氯酸（分析純，批號(hào)20110617，上海金鹿化工有限公司）、乙酸乙酯（分析純，批號(hào)1601101上海申博化工有限公司），水為純化水。

1.2? ? 試驗(yàn)方法

1.2.1? ? 靈芝多糖含量的測(cè)定方法。

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。精密稱取適量于105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對(duì)照品，精密稱定，加水制成0.1 mg/mL的葡萄糖溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分別置于10 mL具塞試管中，各加水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蔥酮溶液（精密稱取蔥酮0.1 g，加硫酸100 mL使之溶解，搖勻）6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置于冰浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，對(duì)照品濃度C在0～15.3 μg/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.052C-0.017 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 1。

（3）供試品溶液的配制。取靈芝粉末2.0 g，精密稱定，按不同條件分別進(jìn)行超聲、浸提方法提取靈芝多糖，趁熱濾過。用少量熱水洗滌濾器和濾渣，合并濾液及洗滌液，減壓濃縮至5 mL，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75 mL，搖勻。在4 ℃條件下放置12 h，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，放冷;加水至刻度線，搖勻，取溶液適量，離心;精密量取上清液3 mL置于25 mL量瓶中，加水至刻度線，搖勻，作為靈芝多糖供試品溶液。

（4）測(cè)定方法。精密量取供試品溶液2 mL，置于10 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，同法操作，以空白試劑作為參比，在波長(zhǎng)625 nm處測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中多糖的含量。

1.2.2? ? 鹿角靈芝多糖提取正交試驗(yàn)。通過單因素試驗(yàn)結(jié)果考察可確定料液比、提取時(shí)間、提取溫度、超聲功率為超聲法提取鹿角靈芝多糖的主要因素，以多糖得率為指標(biāo)，對(duì)鹿角靈芝多糖的最佳提取方法進(jìn)行優(yōu)化。各試驗(yàn)因素的水平見表1。

1.2.3? ? 靈芝三萜的含量測(cè)定方法。

（1）齊墩果酸對(duì)照樣品溶液的制備。取齊墩果酸對(duì)照樣品適量，精密稱定，加甲醇制成0.2 mg/mL的溶液。

（2）齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取對(duì)照樣品溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中，揮干，放冷。精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL）和0.2 mol/L的高氯酸0.8 mL，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出。精密加入乙酸乙酯4 mL，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法，在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果對(duì)照品濃度C在0～20.2 μg/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，回歸方程為A=0.050 7C-0.016 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。

（3）供試樣品溶液的制備。取鹿角靈芝多糖提取后濾渣干燥物約2 g，精密稱定。按不同條件分別進(jìn)行超聲、浸提方法提取靈芝三萜，過濾，用少量乙醇洗滌濾器和濾渣，合并濾液及洗滌液，置于100 mL量瓶中，加乙醇至刻度線，搖勻，作為靈芝三萜供試品溶液。

（4）測(cè)定法。精密量取供試品溶液0.2 mL，置于15 mL具塞試管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法操作，以空白試劑作為參比，于546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中三萜的含量。

1.2.4? ? 鹿角靈芝三萜提取正交試驗(yàn)。通過單因素試驗(yàn)結(jié)果考察確定乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度為超聲法提取鹿角多糖提取后濾渣中靈芝三萜的主要因素，以三萜得率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)，考察上述4個(gè)因素的用量水平，對(duì)靈芝三萜的最佳提取方法進(jìn)行優(yōu)化。各試驗(yàn)因素的水平見表2。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 鹿角靈芝多糖提取正交試驗(yàn)

由表3可知，鹿角靈芝多糖得率最佳配比條件為A2B2C1D3。由表4可知，正交試驗(yàn)分析結(jié)果為RC>RB>RD>RA，即影響鹿角靈芝多糖得率的因素順序?yàn)樘崛囟龋–）>提取時(shí)間（B）>超聲功率（D）>料液比（A）。料液比、提取時(shí)間、提取溫度和超聲功率對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有影響，其中提取溫度（C）、提取時(shí)間（B）顯著影響鹿角靈芝多糖得率。為了證實(shí)最優(yōu)配比條件的可靠性，進(jìn)行3次重復(fù)對(duì)比試驗(yàn)，以驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)定性。3次重復(fù)試驗(yàn)中鹿角靈芝多糖得率的平均值為1.483%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.98%。

2.2? ? 鹿角靈芝三萜提取正交試驗(yàn)

由表5可知，鹿角靈芝三萜得率最佳配比條件為A2B2C3D1。由表6可知，正交試驗(yàn)分析結(jié)果為RA>RC>RD>RB，即影響鹿角靈芝三萜得率的因素順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ）>提取時(shí)間（C）>提取溫度（D）>料液比（B）。乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均有影響，其中乙醇濃度（A）、提取時(shí)間（C）顯著影響鹿角靈芝三萜得率。為了證實(shí)最優(yōu)配比條件的可靠性，進(jìn)行3次重復(fù)對(duì)比試驗(yàn)，以驗(yàn)證結(jié)果的穩(wěn)定性。3次重復(fù)試驗(yàn)中鹿角靈芝三萜得率平均為0.884%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%。

3? ? 結(jié)論與討論

本研究分別以多糖得率、三萜得率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究了超聲波法提取靈芝有效成分的因素，并采用正交試驗(yàn)法對(duì)提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)最優(yōu)化分析，鹿角靈芝中多糖最佳提取工藝條件為靈芝粉碎度為60目、料液比為1∶30，超聲功率為400 W、提取溫度65 ℃、提取時(shí)間為50 min。此提取工藝條件下，鹿角靈芝中多糖提取得率為1.483%。鹿角靈芝中三萜最佳提取工藝條件為乙醇濃度75%、料液比為1∶25、提取溫度50 ℃、提取時(shí)間為40 min。此提取工藝條件下，多糖提取后濾渣中三萜得率為0.884%。對(duì)最佳工藝進(jìn)行了重復(fù)性驗(yàn)證，工藝條件可靠，穩(wěn)定性較好。本試驗(yàn)中，多糖提取采用的原料為藥材鹿角靈芝，三萜提取采用的原料為多糖提取后所剩濾渣。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，多糖提取后所剩下的濾渣中仍有60%以上的三萜類化合物可以利用。按設(shè)計(jì)的最佳工藝方法，可將鹿角靈芝藥材中多糖的大部分成分提取出來，且可將濾渣中的三萜類化合物完全提取出來，三萜提取轉(zhuǎn)移率達(dá)到63.38%。該提取方案合理可行，靈芝利用度較高，為今后靈芝有效成分的連續(xù)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了一條合理、高效的工藝路線，實(shí)現(xiàn)了藥材資源綜合全面且有效的利用。

鹿角靈芝有效成分生產(chǎn)工藝為采用超聲法連續(xù)提取靈芝多糖和靈芝三萜，先水提靈芝多糖，后醇提靈芝三萜。鹿角靈芝采用優(yōu)化的超聲提取方法進(jìn)行靈芝多糖干膏的制備，干膏得率均在10%以上，干膏中多糖的含量均在14%以上，較原藥材提取的多糖提高了9.5%左右;采用鹿角靈芝多糖提取后濾渣作為原料，按優(yōu)化的超聲提取方法進(jìn)行靈芝三萜干膏的制備，干膏得率均在4.0%以上，干膏中三萜的含量均在18.0%以上，較原藥材提取的三萜提高了15.0%左右。此提取方法生產(chǎn)的靈芝提取物含量穩(wěn)定，設(shè)計(jì)的提取工藝可為今后的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)參考。

采用超聲法提取靈芝有效成分具有提取溫度低、時(shí)間短、效率高、工藝簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)，可作為靈芝多糖和靈芝三萜工業(yè)化生產(chǎn)提取的一種高效方法，具有一定的應(yīng)用前景。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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