郭 磊, 潘正元, 劉佳茵, 韓銘軒, 褚 棟

(青島農業(yè)大學植物醫(yī)學學院, 山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室, 山東青島 266109)

煙粉虱Bemisiatabaci是一種世界性分布的重要農業(yè)害蟲。該蟲能通過取食對植物直接造成危害(De Barroetal., 2011)，還可以作為病毒媒介昆蟲傳播近200種植物病毒(Navas-Castilloetal., 2011)，其中包括具有毀滅性的植物病毒——番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)(Scholthofetal., 2011)以及近年來在國內流行的番茄褪綠病毒(tomato chlorosis virus, ToCV)(鄭慧新等, 2016)。煙粉虱是一個含有許多隱種的復合種，目前全世界至少包括44個煙粉虱隱種(Kanakala and Ghanim, 2019)。這些隱種在形態(tài)上難以區(qū)分，但在生物學特性(例如繁殖力、寄主范圍等)上均存在顯著差異(Brown, 2000; Brownetal., 2003)。在中國，煙粉虱MED隱種(即Q型煙粉虱)是目前分布最廣并對作物造成危害最嚴重的煙粉虱隱種。自2003年該隱種在國內首次報道以來，它已逐年取代了其他煙粉虱隱種成為田間煙粉虱優(yōu)勢隱種(Chuetal., 2006, 2010; Tengetal., 2010)。

鈣離子是真核生物細胞內重要的第二信使，其濃度變化是細胞生理功能調控過程中最關鍵的因素之一(Schneider, 1994)。鈣離子結合蛋白(calcium-binding protein, CaBP)含有保守的EF-手型(EF-hand)結構域，并且當其與鈣離子結合后能夠改變三維構象，從而與下游靶標結合引發(fā)后續(xù)生理變化(Kretsinger and Nockolds, 1973; Sorensenetal., 2002)。作為一種細胞內廣泛分布的調控蛋白，鈣離子結合蛋白通過與鈣離子可逆性的結合在鈣離子信號通路中發(fā)揮著重要的作用(Mikhaylovaetal., 2011; Bagur and Hajnóczky, 2017)。由于鈣離子結合蛋白參與細胞從增殖到凋亡的各個環(huán)節(jié)，因此在生物體的正常生長發(fā)育中是一類不可或缺的蛋白。前期研究發(fā)現(xiàn)，煙粉虱體內2個鈣離子結合蛋白(BtCaBP1和BtCaBP2)參與穩(wěn)定細胞內鈣離子濃度，從而增強煙粉虱對雙酰胺類殺蟲劑溴氰蟲酰胺的耐藥能力(Guoetal., 2019)。然而，在上述研究中僅觀察了基因干擾后48 h的自然死亡率，并未對煙粉虱后續(xù)的生物學參數(shù)進行持續(xù)觀察。這2個鈣離子結合蛋白基因表達受到抑制是否影響煙粉虱的生物學特性并不清楚。

為了系統(tǒng)揭示鈣離子結合蛋白對煙粉虱生物學的影響，本研究利用dsRNA飼喂法干擾了煙粉虱2個鈣離子結合蛋白基因(BtCaBP1和BtCaBP2)表達后，進一步比較了處理組與對照組煙粉虱親代雌雄成蟲壽命、單雌產卵量以及子一代卵孵化率和成蟲前期發(fā)育歷期的變化。研究結果進一步明確了BtCaBP1和BtCaBP2對煙粉虱生物學的影響。

1 材料與方法

1.1 試蟲

本實驗的煙粉虱MED隱種初始種群于2012年采自山東省濟南市，在實驗室以棉花(魯棉研28號)進行繼代飼養(yǎng)至今。煙粉虱飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度27±1℃，相對濕度60%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 煙粉虱鈣離子結合蛋白基因的RNA干擾

根據(jù)BtCaBP1(GenBank登錄號: MK204650),BtCaBP2 (GenBank登錄號: MK204651)和EGFP(GenBank登錄號: JQ693016)的序列信息，分別設計dsRNA引物，并在引物5′端添加T7啟動子序列,引物序列見表1。利用Trizol法提取煙粉虱總RNA，根據(jù)TaKaRa反轉錄試劑盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成cDNA，利用PCR分別擴增BtCaBP1,BtCaBP2和EGFP。PCR反應體系(50 μL): cDNA模板2 μL, Ex Taq酶0.25 μL(TaKaRa, 大連), 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL(引物序列見表1), 10×Ex Taq Buffer 5 μL，加水補足50 μL體系。PCR反應程序: 94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 5個循環(huán); 94℃ 30 s, 70℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán)。分別以3個基因的PCR擴增產物為模板，參照Thermo Scientific 體外雙鏈RNA(dsRNA)合成試劑盒(TranscriptAid T7 High Yield Transcription Kit)進行dsRNA的合成。合成后利用酚仿抽提法回收雙鏈RNA，并置于-20℃保存待用。

采用dsRNA飼喂法進行RNA干擾，隨機收集300頭的煙粉虱MED隱種1日齡成蟲，置于50 mL飼喂裝置中，其中飼喂管一側裝有dsRNA (500 ng/μL) 1.5 mL的蔗糖水溶液(25%)，另一側覆蓋有紗網。將裝有試蟲的飼喂管置于人工氣候室中(溫度: 27℃±1℃；相對濕度: 60%±5%)。對照組同樣收集300頭煙粉虱MED隱種1日齡成蟲，飼喂含有等量dsEGFP的蔗糖水溶液。飼喂 dsRNA 3 d后，隨機取出3組煙粉虱，每組30頭。利用上述方法提取煙粉虱總RNA并合成cDNA，利用qPCR法檢測RNA干擾效果。qPCR反應體系(20 μL): cDNA模板1 μL, 2×SYBR?Premix Ex TaqⅡ預混液10 μL(TaKaRa, 大連), 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL(引物序列見表1), 加水補足20 μL體系。陰性對照為不加任何模板的qPCR反應。所有樣品3個生物學重復。qRT-PCR反應程序: 95℃ 30 s; 95℃ 10 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)。循環(huán)結束后添加溶解曲線。根據(jù)前期研究結果(Lietal., 2013; Guoetal., 2017)，本實驗選擇琥珀酸脫氫酶復合物亞基A基因(SDHA)作為內參基因，并采用2-ΔΔCt分析目標基因的相對表達水平(Pfaffl, 2001)。

表1 本實驗所用引物序列Table 1 Primers used in the study

1.3 鈣離子結合蛋白基因干擾后煙粉虱MED隱種親代壽命和產卵量觀測

收集1.2節(jié)中飼喂dsRNA 3 d后的煙粉虱MED隱種成蟲，分辨雌雄并按照雌∶雄=1∶1的比例放入預先準備好的水培棉花苗中，5～10對一組，3組重復。每天檢查棉花苗中成蟲的死亡情況以及死亡成蟲的性別，每5 d更換一次葉片，并統(tǒng)計葉片上的卵數(shù)。直至所有成蟲死亡。計算親代成蟲單雌產卵量，單雌產卵量={∑[每棉花苗上5 d總卵量/(總雌蟲數(shù)+第1天總活雌蟲數(shù)+第2天總活雌蟲數(shù)+…+第5天總雌蟲數(shù))]}×5。

1.4 鈣離子結合蛋白基因干擾后煙粉虱MED隱種子代生長發(fā)育指標測定

收集1.2節(jié)中飼喂dsRNA 3 d后的煙粉虱MED隱種成蟲分辨雌雄并按照雌∶雄=1∶1的比例放入預先準備好的水培棉花苗中，15～20對一組，3組重復。在水培苗中產卵24 h后，清除所有成蟲。每天記錄水培棉花苗上卵的孵化情況，以及子一代成蟲前期的生長發(fā)育情況。需統(tǒng)計的子一代生物學參數(shù)包括卵孵化率和成蟲前期的發(fā)育歷期。

1.5 數(shù)據(jù)分析

基因表達水平、親代雌雄成蟲壽命、單雌產卵量以及子一代卵孵化率和成蟲前期發(fā)育歷期采用平均值±標準差的形式表示。利用Graphpad 3.0軟件，采用Student氏t檢驗方法進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果

2.1 飼喂dsRNA后煙粉虱MED隱種成蟲體內靶標基因的表達水平變化

飼喂dsRNA 3 d后，利用qPCR的方法檢測不同處理組中靶標基因mRNA的表達水平。與飼喂dsEGFP的對照組相比，飼喂dsBtCaBP1的處理組煙粉虱MED隱種成蟲BtCaBP1表達水平降低了36.30%(P<0.05)，而飼喂dsBtCaBP2 3 d后煙粉虱MED隱種成蟲體內BtCaBP2表達水平降低了47.01%(P<0.05)(圖1)。因此，飼喂dsBtCaBP和dsBtCaBP2 3 d均能夠顯著降低煙粉虱MED隱種成蟲體內相應靶標基因的表達水平。

2.2 鈣離子結合蛋白基因干擾后對煙粉虱MED隱種親代成蟲壽命的影響

與飼喂dsEGFP的對照組雌成蟲壽命(13.25±0.58 d)相比，干擾BtCaBP1后雌成蟲壽命(12.58±1.11 d)沒有明顯變化(P>0.05)，而干擾BtCaBP2后雌成蟲壽命(15.46±1.24 d)顯著延長(P<0.05)(圖2: A)。相似的情況同樣出現(xiàn)在雄蟲中，飼喂dsBtCaBP2后雄成蟲壽命延長至13.84±0.38 d，顯著大于對照組的雄成蟲壽命(12.67±0.65 d)(P<0.05)，而飼喂dsBtCaBP1的雄成蟲壽 命(12.71±0.67 d)沒有顯著變化(P>0.05)(圖2: B)。

圖1 分別飼喂dsEGFP, dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后煙粉虱MED隱種成蟲體內BtCaBP基因的相對表達量Fig. 1 Relative expression levels of BtCaBP genes in Bemisia tabaci MED adults after feeding on dsEGFP,dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d圖中數(shù)據(jù)為3次實驗重復的平均值±標準差；柱上星號表示與對照組(飼喂dsEGFP)相比經Student氏t檢驗方法比較在P<0.05水平差異顯著。Data in the figure are mean±SD (n=3). The asterisk above bars indicates significant difference from the control (feeding on dsEGFP) by Student’s t-test (P<0.05). 下圖同The same for the following figures.

圖2 分別飼喂dsEGFP, dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后煙粉虱MED隱種親代雌(A)和雄(B)成蟲壽命Fig. 2 Longevity of female (A) and male (B) adults of Bemisia tabaci MED after feeding on dsEGFP, dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

2.3 鈣離子結合蛋白基因干擾后對煙粉虱MED隱種親代產卵量的影響

與對照組的單雌產卵量(76.06±4.76)相比，干擾BtCaBP2后親代單雌產卵量(39.53±3.04)顯著下降(P<0.05)，而干擾BtCaBP1后親代單雌產卵量(63.47±4.26)與對照組沒有顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 分別飼喂dsEGFP, dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后煙粉虱MED隱種親代成蟲的單雌產卵量Fig. 3 Number of eggs laid per female adult of Bemisia tabaci MED feeding on dsEGFP,dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

2.4 鈣離子結合蛋白基因干擾后對子一代煙粉虱MED隱種卵孵化率的影響

與對照組子一代卵孵化率(87.22%±3.21%)相比，干擾BtCaBP1后子一代卵孵化率(83.22%±7.55%)沒有明顯變化(P>0.05)，而干擾BtCaBP2后卵孵化率(81.58%±4.42%)顯著降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 親代煙粉虱MED隱種成蟲分別飼喂dsEGFP,dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后子一代的卵孵化率Fig. 4 Egg hatching rate of offspring of Bemisia tabaci MED adults feeding on dsEGFP, dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

2.5 鈣離子結合蛋白基因干擾后對子一代煙粉虱MED隱種成蟲前期發(fā)育歷期的影響

干擾BtCaBP1后子一代成蟲前期發(fā)育歷期(26.66±0.73 d)與對照組(27.52±1.73 d)之間沒有顯著差異(P>0.05)，而干擾BtCaBP2后子一代成蟲前期發(fā)育歷期(24.42±1.09 d)顯著縮短(P<0.05)(圖5)。

圖5 親代煙粉虱MED隱種成蟲分別飼喂dsEGFP,dsBtCaBP1和dsBtCaBP2 3 d后子一代成蟲前期發(fā)育歷期Fig. 5 Pre-adult duration of offspring of Bemisia tabaci MED adults feeding on dsEGFP, dsBtCaBP1 and dsBtCaBP2, respectively, for 3 d

3 討論

本研究通過dsRNA飼喂法干擾煙粉虱鈣離子結合蛋白基因BtCaBP1和BtCaBP2后，發(fā)現(xiàn)煙粉虱2個鈣離子結合蛋白基因干擾具有不同的生物學效應，其中BtCaBP2基因干擾后煙粉虱的單雌產卵量顯著降低，并且子一代卵孵化率受到了明顯的抑制；而BtCaBP1基因干擾后則沒有顯著生物學效應。已有研究表明鈣離子結合蛋白及其參與的鈣離子信號通路在無脊椎動物某些特定的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用(Taft and Yoshino, 2011)。其中，鈣調素作為一種保守性最高的鈣離子結合蛋白在昆蟲的生長發(fā)育過程中被廣泛研究。研究表明，鈣調素在果蠅Drosophila胚胎中線期的信號轉導過程中發(fā)揮著重要作用，降低鈣調素的調控水平會嚴重影響胚胎的正常發(fā)育(Hsouna and Vanberkum, 2008)。利用選擇性的抑制劑干擾血吸蟲Schistosomamansoni體內鈣調素的功能后，能夠干擾血吸蟲卵的正常孵化，造成幼蟲的非正常發(fā)育，最終導致死亡(Katsumataetal., 1989; Kawamotoetal., 1989)。近期有研究顯示，通過飼喂干擾褐飛虱Nilaparvatalugens體內鈣調素基因表達后，若蟲無法正常蛻皮，雌成蟲體內卵黃蛋白顯著下降，雌成蟲繁殖力顯著下降，因此鈣調蛋白可能作為害蟲防控中的一個重要靶標(Wangetal., 2018)。結合本實驗結果及上述研究表明，鈣離子結合蛋白通過調控鈣離子的信號轉導在昆蟲及其他無脊椎動物的發(fā)育和繁殖過程中發(fā)揮著關鍵作用。但是，分別干擾BtCaBP1 與BtCaBP2為何對煙粉虱發(fā)育產生的影響不同，BtCaBP2基因是如何對煙粉虱生殖力以及卵的發(fā)育產生影響，以及BtCaBP1基因是否能夠從其他方面對煙粉虱產生影響尚需進一步證明。

干擾BtCaBP2對煙粉虱繁殖力和卵孵化率產生抑制作用，但是煙粉虱親代成蟲的壽命卻顯著增加，子一代成蟲前期發(fā)育歷期顯著縮短。前人研究表明，鈣離子結合蛋白通過參與刺吸式口器昆蟲取食過程中對植物防御反應的影響，從而改變昆蟲的生長發(fā)育狀態(tài)。具體表現(xiàn)在刺吸式口器昆蟲在取食時會釋放出大量鈣離子結合蛋白，該類蛋白能夠消除鈣離子誘導的植物體篩管內阻塞物的形成(Willetal., 2009)。例如，巢菜修尾蚜Megouraviciae在取食時會釋放出鈣離子結合蛋白，與豆科植物篩管中的鈣離子結合，引起forisome蛋白的收縮，進一步阻止了篩管的阻塞并保證了蚜蟲的持續(xù)取食(Willetal., 2007; Atamianetal., 2013)。稻葉蟬Nephotettixcincticeps取食時同樣會向篩管中釋放出一種抑制篩管堵塞的鈣離子結合蛋白以保證其正常的取食行為(Hattorietal., 2012)。因此，如果干擾刺吸式口器昆蟲在取食過程中釋放到植物中的特定鈣離子結合蛋白，會增強植物的防御反應，進一步阻礙刺吸式口器昆蟲的正常取食，從而造成死亡率的顯著增加(Yeetal., 2017)。我們推測，本研究中的BtCaBP2可能并不屬于煙粉虱取食過程中分泌到植物中的一種鈣離子結合蛋白，因此干擾BtCaBP2不會通過改變植物的防御反應的變化影響親代煙粉虱的壽命。其次，BtCaBP2更可能在煙粉虱生殖方面發(fā)揮著關鍵作用。在多數(shù)昆蟲生長發(fā)育中存在一種權衡關系(trade-off)，即繁殖力的增加是以生存能力的降低為代價的(Williams, 1966; Harshman and Zera, 2007)。由于BtCaBP2處理組煙粉虱繁殖力明顯減弱，因此更多的能量可能用于蟲體自身的生存能力，導致親代成蟲的壽命顯著延長，子一代成蟲前期的發(fā)育歷期明顯縮短。

綜上所述，本研究表明，與BtCaBP1相比，BtCaBP2在煙粉虱的繁殖與生長發(fā)育中發(fā)揮著更加重要的作用，該結果為后續(xù)進一步研究鈣離子結合蛋白的生物學功能提供了參考。