珠娜 郝云濤 劉欣然 李勇

睡眠是指人或動(dòng)物的相對(duì)“靜止”或“休息”的時(shí)段。根據(jù)簡(jiǎn)單的行為學(xué)定義，人與動(dòng)物的睡眠是指知覺(jué)解除對(duì)周?chē)h(huán)境反應(yīng)的一種可逆性行為狀態(tài)[1]?，F(xiàn)如今，由于生活節(jié)奏的加快，大多數(shù)人沒(méi)有充足的睡眠時(shí)間并處于高壓力的生活方式、缺乏鍛煉、咖啡的攝入量大大增加、噪音和光照時(shí)間延長(zhǎng)等均可影響人群的睡眠質(zhì)量。睡眠質(zhì)量差無(wú)疑對(duì)白天的功能和身體狀態(tài)有明顯的不良影響，導(dǎo)致白天容易疲勞、情緒不穩(wěn)、更容易感到焦慮和壓力等。而持續(xù)的睡眠不足和晝夜節(jié)律改變會(huì)導(dǎo)致睡眠障礙，進(jìn)而引起高血壓、心血管疾病、肥胖和糖尿病等[2-4]。通過(guò)藥物的手段改善睡眠存在許多副作用及不良影響，如過(guò)度鎮(zhèn)靜、耐受性、成癮性、反跳性失眠、精神神經(jīng)異常反應(yīng)、記憶障礙和中毒反應(yīng)等[5]。因此，利用安全、毒副作用小的天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)改善睡眠是重要手段之一。

核桃是公認(rèn)的褪黑素的天然來(lái)源，富含蛋白質(zhì)，且氨基酸種類(lèi)齊全，其中色氨酸可以促進(jìn)血清素和褪黑激素的分泌，谷氨酸可促進(jìn)γ-氨基丁酸的合成，這些都是核桃中改善睡眠的功能成分[6-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，核桃具有良好的改善睡眠的作用[9]。核桃低聚肽(walnut oligopeptides, WOPs)是水解核桃蛋白提取的小分子生物活性肽，其吸收優(yōu)于核桃蛋白，且有豐富的氨基酸含量，尤其是與合成γ-氨基丁酸有關(guān)的谷氨酸，對(duì)改善睡眠有積極的作用。WOPs具有顯著的抗氧化功能，可有效清除自由基，對(duì)腦神經(jīng)有保護(hù)[10-11]。本研究以BALB/c小鼠為研究對(duì)象，研究WOPs對(duì)改善小鼠睡眠功效的影響，為開(kāi)發(fā)安全、毒副作用小的天然催眠食品提供科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

一、 材料

1.主要試劑：核桃低聚肽(北京天肽生物科技有限公司，淡黃色固體粉末，分子量小于1 000 Da的低聚肽占86.3%，小于2 000 Da的肽類(lèi)總量96.5%，游離氨基酸含量2.98 g/100 g，精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量較多)，戊巴比妥鈉(上海三抒生物科技公司)，巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司)，小鼠γ-氨基丁酸ELISA試劑盒(andygene)，小鼠5-羥色胺ELISA試劑盒(andygene)，小鼠多巴胺ELISA試劑盒(andygene)。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠150只，6～8 周齡，體重 18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0010，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(京)2016-0041。

二、 方法

1.動(dòng)物分組與處理：將小鼠隨機(jī)分為5個(gè)劑量組，分別為空白對(duì)照組、乳清蛋白對(duì)照組(440 mg/kg BW)、WOPs低、中、高劑量組(WOPs-LG：220 mg/kg BW、WOPs-MG：440 mg/kg BW、WOPs-HG：880 mg/kg BW)。各組小鼠飼養(yǎng)于屏障級(jí)動(dòng)物室，喂飼SPF級(jí)生長(zhǎng)繁殖飼料，自由飲食和飲水，連續(xù)灌胃不同受試物水溶液30 d。

2.直接睡眠實(shí)驗(yàn)：末次灌胃后，觀察各組小鼠是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射(當(dāng)正常小鼠處于背臥位時(shí)會(huì)立即翻正身位)消失為指標(biāo)。如超過(guò)30～60 s不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動(dòng)物覺(jué)醒。翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間，記錄各組入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。

3.延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)：末次灌胃1 h后，給各組動(dòng)物腹腔注射36 mg/kg BW戊巴比妥鈉，注射量為0.2 ml/20 g，以反正反射消失為指標(biāo)，觀察受試物樣品能否延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。

4.戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)：末次灌胃1 h后，給各組動(dòng)物腹腔注射30 mg/kg BW戊巴比妥鈉，注射量為0.2 ml/20 g，以小鼠翻正反射消失達(dá)1s以上者為入睡標(biāo)準(zhǔn)，記錄30 s內(nèi)入睡動(dòng)物數(shù)。

5.巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)：末次灌胃1 h后，給各組動(dòng)物腹腔注射260 mg/kg BW巴比妥鈉，注射量為0.2 ml/20 g，以反正反射消失為指標(biāo)，觀察受試物樣品對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

6.腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)：末次灌胃1 h后，頸椎脫臼處死小鼠，迅速取出腦組織，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)小鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸(GABA)、五羥色胺(5-HT)，多巴胺(DA)含量。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 22.0軟件對(duì)各實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。直接睡眠實(shí)驗(yàn)的入睡動(dòng)物數(shù)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)入睡動(dòng)物數(shù)為計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)，四格表總例數(shù)小于40，或總例數(shù)等于或大于40 但出現(xiàn)理論數(shù)等于或小于1 時(shí)，應(yīng)改用確切概率法。各組間率的多重比較采用調(diào)整檢驗(yàn)水準(zhǔn)的Step—down Bonferroni 法，P′j=(c -j +1)Pj。

結(jié) 果

一、 WOPs對(duì)小鼠直接睡眠的影響

空白對(duì)照組、乳清蛋白組、WOP-LG、WOPs-MG及WOPs-HG在給予受試物60 s內(nèi)，均未發(fā)生直接睡眠現(xiàn)象。

二、WOPs對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響

乳清蛋白、WOP-LG、WOPs-MG及WOPs-HG的干預(yù)不同程度的延長(zhǎng)了戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間。與空白對(duì)照組相比，WOP-LG、WOPs-MG小鼠睡眠時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與乳清蛋白組相比，WOPs-MG小鼠的睡眠時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 WOPs對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響

Note:*P<0.05 versus control group;#P<0.05 versus whey protein group

三、 WOPs對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠入睡發(fā)生率的影響

與空白對(duì)照組相比，乳清蛋白、WOP-LG、WOPs-MG及WOPs-HG干預(yù)可以增加在 30 s內(nèi)小鼠的入睡比率，分別增加了20、50、70和60個(gè)百分點(diǎn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與乳清蛋白組相比，WOP-LG、WOPs-MG及WOPs-HG小鼠30 min內(nèi)入睡比例分別增加了30、50和40個(gè)百分點(diǎn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

四、 WOPs對(duì)小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

與空白對(duì)照組相比，不同受試物干預(yù)均顯著縮短了小鼠的巴比妥鈉睡眠潛伏期(P<0.05)，其中，WOPs-MG可將小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期時(shí)間最大由空白對(duì)照組(41.62±7.93) s縮短至(22.73±4.72) s；與乳清蛋白組相比，WOPs-LG、WOPs-MG及WOPs-HG小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期亦顯著縮短(P<0.05)。見(jiàn)表3。

五、 WOPs對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與空白對(duì)照組相比，WOPs-LG和WOPs-MG小鼠腦內(nèi)5-HT含量顯著增高(P<0.05)，WOPs-LG、WOPs-MG和WOPs-HG小鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量顯著增高(P<0.05)；與乳清蛋白組相比，WOPs-MG小鼠腦內(nèi)5-HT含量顯著增高(P<0.05)，WOPs-MG和WOPs-HG小鼠腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量顯著增高(P<0.05)；腦內(nèi)多巴胺含量在各組之間沒(méi)有顯著變化(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表2 WOPs對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠入睡發(fā)生率的影響

表3 WOPs對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏的影響

Note:*P<0.05 versus control group;#P<0.05 versus whey protein group

表4 WOPs對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響

Note:*P<0.05 versus control group;#P<0.05 versus whey protein group

討 論

睡眠是人類(lèi)維持生命活動(dòng)所必需的生理現(xiàn)象，與機(jī)體健康及生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。通過(guò)睡眠可以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、消除疲勞，從而保證高效的工作效率及良好的生活質(zhì)量。雖然短暫的失眠是大多數(shù)人都會(huì)經(jīng)歷的一種亞健康狀態(tài)，但是長(zhǎng)期的失眠不僅會(huì)嚴(yán)重的影響機(jī)體健康，還會(huì)降低生產(chǎn)力，增加事故的發(fā)生率。因此，良好的睡眠不僅對(duì)個(gè)人還是社會(huì)的良性發(fā)展都是至關(guān)重要的。近年，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)W者研究證實(shí)了酸棗、白芍提取物，茶氨酸及復(fù)合維生素B等許多天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)改善睡眠方面的功能，具有重大的公共衛(wèi)生學(xué)意義[12-14]。生物活性肽具有肽唯有的獨(dú)特的生理活性，例如抗氧化、改善學(xué)習(xí)記憶、保護(hù)腦神經(jīng)、改善認(rèn)知障礙等[15-17]，具備改善睡眠的潛力。但生物活性肽改善睡眠方面的研究較少，只見(jiàn)菜籽多肽改善睡眠方面的報(bào)道[18-19]。本實(shí)驗(yàn)探討了WOPs的改善睡眠作用，為避免單純?cè)黾拥鞍踪|(zhì)的攝入量而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果特設(shè)立了乳清蛋白對(duì)照組，結(jié)果顯示，WOPs沒(méi)有直接誘導(dǎo)睡眠的作用，可延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間，顯著縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期，但對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠入睡發(fā)生率沒(méi)有顯著影響。

本研究為了探討WOPs改善睡眠作用的相關(guān)機(jī)制，檢測(cè)了腦內(nèi)睡眠相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)，包括5-HT，γ-氨基丁酸及多巴胺。5-HT能神經(jīng)元位于腦干的延髓、腦橋和中腦中線(xiàn)或“中縫”的核團(tuán)內(nèi)，在睡眠-覺(jué)醒狀態(tài)中起了非常重要的作用，參與了睡眠的發(fā)生和維持[20]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，破壞貓的中縫核5-HT 能神經(jīng)元可引起腦內(nèi)5-HT 含量減少，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同程度的失眠，而對(duì)1例嚴(yán)重失眠患者進(jìn)行5-羥色氨酸治療, 發(fā)現(xiàn)一定程度的改善了失眠癥狀[21]。γ-氨基丁酸是由谷氨酸經(jīng)過(guò)谷氨酸脫羧酶催化而來(lái)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。γ-氨基丁酸可以延長(zhǎng)貓及小鼠的睡眠時(shí)間，并能改善貓的失眠癥狀[22]。多巴胺是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)與覺(jué)醒相關(guān)的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，多巴胺水平升高導(dǎo)致覺(jué)醒增加而睡眠減少[23]。本實(shí)驗(yàn)條件下，WOPs可顯著增加腦內(nèi)γ-氨基丁酸含量，也可增加腦內(nèi)5-HT含量，但對(duì)多巴胺水平無(wú)顯著影響。到目前為止尚未發(fā)現(xiàn)WOPs對(duì)上述三種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報(bào)道，而有文獻(xiàn)顯示核桃可以增加腦內(nèi)5-HT和γ-氨基丁酸含量[24-25]。

綜上所述，WOPs可延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間，顯著縮短巴比妥鈉睡眠潛伏期，具有輔助睡眠作用，其機(jī)制可能與增加腦內(nèi)5-HT、γ-氨基丁酸等抑制性神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。