鄒威鳳 王曉茜 盛青 周曉婷 黎希

廣州市胸科醫(yī)院呼吸科510000

COPD主要的病理改變包括氣道慢性炎癥和氣道重塑,其中,小氣道重塑是引起COPD患者持續(xù)存在的氣流受限的主要原因。既往研究表明高遷移率族蛋白1(high mobility group protein B1,HMGB1)/晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)信號(hào)通路參與了COPD氣道炎癥和重塑,且與氣道阻塞程度呈正相關(guān)[1-2]。HMGB1/RAGE信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)促纖維因子轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(fibroblast growth factor 2,FGF-2)的分泌從而參與肺纖維化形成[3]。吸煙作為影響COPD發(fā)生、發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素,研究表明香煙煙霧可誘導(dǎo)大鼠肺和氣道HMGB1/RAGE的表達(dá)[4-5],體外研究顯示香煙煙霧提取物可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞A549和R3/1細(xì)胞株中RAGE及其配體的表達(dá)[6]。我們前期研究已證實(shí)香煙煙霧主要成分之一尼古丁可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中HMGB1[7]的分泌。本研究旨在探討尼古丁是否通過(guò)HMGB1/RAGE信號(hào)通路調(diào)控氣道上皮細(xì)胞TGF-β1和FGF-2的分泌。

1 材料與方法

1.1 材料 人氣道上皮細(xì)胞株16HBE(廣州醫(yī)科大學(xué)提供),DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司),尼古丁(美國(guó)SanDiego公司),HMGB1 siRNA、RAGE抗體、RAGE中和抗體、IgG抗體(美國(guó)R&D公司),HMGB1、TGF-β1和FGF-2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司)。

1.2 正常人支氣管上皮細(xì)胞株HBE培養(yǎng)及處理 10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,按2×10-5細(xì)胞/瓶將細(xì)胞接種于6孔板中,使細(xì)胞生長(zhǎng)再次達(dá)到60%～70%融合?？瞻讓?duì)照組換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,尼古丁(6×10-6mol/L)刺激細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞。其中HMGB1 siRNA處理組分組:空白對(duì)照組、尼古丁組、陰性對(duì)照siRNA+尼 古 丁 組、HMGB1 siRNA+尼 古 丁 組、HMGB1 siRNA+空白對(duì)照組;RAGE中和抗體處理組分組:空白對(duì)照組、尼古丁組、IgG+尼古丁組、RAGE中和抗體+尼古丁組(每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間取出培養(yǎng)板,各孔的培養(yǎng)上清液離心,取上清液于小離心管中-70℃保存,備用。

1.3 HMGB1 siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞干預(yù)前24 h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,使得次日進(jìn)行干預(yù)時(shí)細(xì)胞融合達(dá)60%。將脂質(zhì)體與HMGB1 siRNA和陰性對(duì)照siRNA均按6μl∶6μl分別加入100 ml DMEM培養(yǎng)基,二者混合后室溫下放置20 min。分別加入干擾組、陰性對(duì)照組,常規(guī)體外培養(yǎng)5 h。再加入1 ml DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)19 h。

1.4 RAGE中和抗體轉(zhuǎn)染 細(xì)胞干預(yù)前24 h將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,2 ml含F(xiàn)BS的無(wú)抗生素基礎(chǔ)培養(yǎng)基,接種密度為2×10-5/孔,使得次日進(jìn)行干預(yù)時(shí)細(xì)胞融合達(dá)60%。將RAGE中和抗體和陰性對(duì)照IgG抗體分別加入干擾組、陰性對(duì)照組,預(yù)先培養(yǎng)1 h。再繼續(xù)加入尼古丁刺激培養(yǎng)24 h。

1.5 ELISA檢測(cè) ELISA檢測(cè)人支氣管上皮細(xì)胞HMGB1、TGF-β1和FGF-2的分泌采用ELISA試劑盒測(cè)定培養(yǎng)液HMGB1、TGF-β1和FGF-2含量,檢測(cè)方法按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示,兩個(gè)樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn);多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組中HMGB1蛋白分泌的比較ELISA檢測(cè)顯示,尼古丁刺激24 h后HMGB1蛋白的分泌量較未給予尼古丁刺激的正常對(duì)照組明顯增加,經(jīng)HMGB1 siRNA預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù)24 h,HMGB1蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁干預(yù)組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而給予陰性對(duì)照siRNA預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù),HMGB1蛋白分泌量與單純尼古丁干預(yù)組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

圖1 ELISA顯示經(jīng)HMGB1 siRNA預(yù)處理后HMGB1蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁組明顯減少

2.2 不同處理組中RAGE蛋白表達(dá)的比較Western blotting檢測(cè)顯示,尼古丁刺激24 h后RAGE蛋白的表達(dá)量較未給予尼古丁刺激的正常對(duì)照組明顯增加,經(jīng)HMGB1 siRNA預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù)24 h,RAGE蛋白在干擾組的表達(dá)量比單純的尼古丁干預(yù)組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而給予陰性對(duì)照siRNA預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù),RAGE蛋白表達(dá)量與單純尼古丁干預(yù)組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

Western blotting檢測(cè)顯示,經(jīng)RAGE中和抗體預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù),RAGE蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁干預(yù)組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);給予陰性對(duì)照IgG預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù)24 h,RAGE的蛋白分泌與單純尼古丁干預(yù)組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.3 不同處理組中TGF-β1和FGF-2蛋白分泌的比較結(jié)果 見(jiàn)圖4。ELISA檢測(cè)顯示,尼古丁刺激24 h后TGF-β1和FGF-2蛋白的分泌量較未予尼古丁刺激的空白對(duì)照組明顯增加,經(jīng)HMGB1 siRNA或RAGE中和抗體預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù)24 h,TGF-β1和FGF-2蛋白在干擾組的分泌量比單純的尼古丁干預(yù)組明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而給予陰性對(duì)照siRNA或IgG預(yù)處理后再給予尼古丁干預(yù),TGF-β1和FGF-2蛋白分泌量與單純尼古丁干預(yù)組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖2 Western blotting顯示經(jīng)HMGB1 siRNA預(yù)處理后RAGE蛋白表達(dá)的比較

3 討論

吸煙是公認(rèn)的導(dǎo)致COPD發(fā)病和不可逆氣流受限進(jìn)展的最為重要的致病因素,其中主要成分之一尼古丁可能會(huì)通過(guò)上調(diào)促纖維化因子而參與COPD中的氣道重塑,氣道重塑是COPD發(fā)生、發(fā)展最主要的機(jī)制之一。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)尼古丁可誘導(dǎo)HMGB1和TGF-β1的分泌。研究報(bào)道損傷的上皮細(xì)胞可分泌各種促纖維化因子,其中包括TGF-β1[8]和FGF-2[9]。HMGB1/RAGE信 號(hào) 通 路可進(jìn)一步通過(guò)調(diào)節(jié)促纖維因子TGF-β1和FGF-2的分泌從而參與氣道重塑形成[10]。

HMGB1是廣泛存在于真核細(xì)胞核中重要的非組蛋白之一,具有多種核外的生物學(xué)功能,與誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移等密切相關(guān)。并在多種組織和細(xì)胞中廣泛分布。病理狀態(tài)下,細(xì)胞破壞可引起HMGB1釋放到細(xì)胞間隙并結(jié)合相應(yīng)的受體如RAGE、Toll樣受體2(toll-like receptor 2,TLR-2)、TLR-4,從而合成并釋放細(xì)胞因子[11]。其中RAGE屬于免疫球蛋白的一種,是一種跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。釋放到細(xì)胞間隙的HMGB1可上調(diào)RAGE的表達(dá)。RAGE高水平表達(dá)于正常肺組織,尤其是肺內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞。體外研究顯示香煙煙霧提取物可促進(jìn)肺上皮細(xì)胞A549和R3/1細(xì)胞株中RAGE及其配體的表達(dá)。

圖3 Western blotting顯示經(jīng)RAGE中和抗體預(yù)處理后RAGE蛋白表達(dá)的比較

我們前期研究已證實(shí)香煙煙霧主要成分之一尼古丁可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞中HMGB1的分泌。結(jié)合我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測(cè)尼古丁可能通過(guò)HMGB1/RAGE信號(hào)通路調(diào)控氣道上皮細(xì)胞TGF-β1和FGF-2分泌,從而參與了吸煙所致的COPD氣道重塑。為此我們觀察了HMGB1/RAGE信號(hào)通路在尼古丁調(diào)控16HBE細(xì)胞TGF-β1和FGF-2分泌中的作用,結(jié)果顯示尼古丁可誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞HMGB1、TGF-β1和FGF-2的分泌和RAGE表達(dá)。既往研究報(bào)道HMGB1可主要通過(guò)RAGE配體誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞中各種細(xì)胞因子的分泌[11-12]。因此我們?cè)诟鲗?shí)驗(yàn)組加入HMGB1 siRNA后,檢 測(cè)RAGE的 表 達(dá) 量 及TGF-β1和FGF-2的分泌量。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)HMGB1 siRNA干預(yù)后,HMGB1的分泌量較單純尼古丁刺激組明顯減少,RAGE的表達(dá)量顯著減少。同時(shí)TGF-β1和FGF-2的分泌量較單純尼古丁刺激組顯著減少。這說(shuō)明HMGB1/RAGE可能在尼古丁誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞TGF-β1和FGF-2的分泌中起重要作用。

圖4 ELISA顯示TGF-β1和FGF-2蛋白在干擾組的分泌量比尼古丁組明顯減少 A:HMGB1siRNA干擾后TGF-β1和FGF-2蛋白表達(dá)量;B:RAGE中和抗體干擾后TGF-β1和FGF-2蛋白表達(dá)量

也有研究報(bào)道HMGB1可通過(guò)配體TLR-2和TLR-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中各種細(xì)胞因子的分泌[13]?；诖?我們?cè)诟鲗?shí)驗(yàn)組進(jìn)一步加入RAGE中和抗體預(yù)處理后,檢測(cè)TGF-β1和FGF-2的分泌量。實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)RAGE中和抗體預(yù)處理后,TGF-β1和FGF-2的分泌量較單純尼古丁刺激組顯著減少。通過(guò)分析我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與既往的文獻(xiàn),提示HMGB1可能通過(guò)促進(jìn)RAGE的表達(dá)參與了尼古丁調(diào)控人支氣管上皮細(xì)胞TGF-β1和FGF-2的分泌,從而促進(jìn)了吸煙所致COPD患者氣道的重塑。該研究為尋找更有針對(duì)性的治療吸煙相關(guān)的COPD的新靶點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突