陳麗艷，崔貝貝，孫銀玲，陳繼亮，曹 陽(yáng)，鄭宏宇，王 萍，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036）

豆豉為我國(guó)傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食療作用，通常是在自然條件下由多菌種混合發(fā)酵制得，因生產(chǎn)環(huán)境、輔料及制備工藝等不同，制得的豆豉風(fēng)味和生理活性物質(zhì)含量也不盡相同[1-3]。中藥淡豆豉是大豆與青蒿、桑葉或紫蘇、麻黃等經(jīng)發(fā)酵加工制成，因發(fā)酵時(shí)加入不同藥材而產(chǎn)生不同的藥性[4-5]。豆豉和中藥淡豆豉中均含有豆豉纖溶酶，能有效溶解血栓并抑制血栓形成，且安全無(wú)毒副作用[6-7]。

心腦血管疾病患者常伴有氣虛血瘀，因此溶栓的同時(shí)需兼顧補(bǔ)氣，而人參（Panax ginsengC.A.Mey.）為首選的補(bǔ)氣中藥，常用于氣血兩虛證，既能補(bǔ)氣以行血，又有一定的活血之功，可用治血脈瘀滯諸證[8]。另外，衛(wèi)生部2012年第17號(hào)公告已批準(zhǔn)人參（人工種植）為新資源食品，并規(guī)定了人參的食用量，為人參在食療產(chǎn)品的應(yīng)用提供依據(jù)。另?yè)?jù)報(bào)道，一些人參皂苷成分口服生物利用度低，需經(jīng)腸道微生物轉(zhuǎn)化為次級(jí)苷或苷元而發(fā)揮更強(qiáng)的藥理作用[9-10]，已有學(xué)者在體外利用微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化[11-12]。

目前，尚鮮見(jiàn)在豆豉的制備中加入人參的相關(guān)報(bào)道，本研究以人參和黃豆為發(fā)酵基質(zhì)，利用從淡豆豉中分離篩選的優(yōu)勢(shì)菌種純種發(fā)酵制備人參豆豉（參豉），以期增加豆豉的益氣活血作用，并實(shí)現(xiàn)人參皂苷的體外生物轉(zhuǎn)化，提高生物利用度。以纖溶酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)發(fā)酵菌株、人參與黃豆的質(zhì)量比、人參的加入方式、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間的考察以確定參豉的最佳發(fā)酵工藝，并利用薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）及高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析發(fā)酵前后人參皂苷的變化，為參豉作為食療產(chǎn)品的應(yīng)用及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黃豆：由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，2017年種植采收，為豆科植物大豆[Glycine max（Linn.）Merr]的干燥成熟種子。人參：由吉林省百濟(jì)堂參業(yè)有限公司提供，種植5年，2017年采收，為五加科植物人參的干燥根。

1.1.2 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）DC-1、傘枝梨頭霉（Absidia corymbifera）DC-11：分離自淡豆豉飲片（黑龍江產(chǎn)地和山東產(chǎn)地），保存至黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥所生物工程研究室；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）GB-1、GB-2、GB-3、GB-4（標(biāo)準(zhǔn)菌株）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

人參皂苷對(duì)照品Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh1、Rck（純度均≥98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品、纖維蛋白原、凝血酶原：中國(guó)食品藥品檢定研究院；薄層硅膠G：青島海洋化工有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜級(jí)）：美國(guó)TTEDIA試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DL-CJ-2N凈化工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；MF3多功能一體機(jī)：杭州迅數(shù)科技有限公司；DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；e2695-2489高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 參豉發(fā)酵工藝

將黃豆按照1∶1.2（g∶g）的比例加蒸餾水（或人參提取液）浸泡，待溶液吸盡，裝袋，于121 ℃高壓滅菌40 min，室溫放置，作為發(fā)酵基質(zhì)。按照2%（V/V）的接種量接種各發(fā)酵菌液（106～108CFU/mL），搖勻，培養(yǎng)，即得參豉發(fā)酵產(chǎn)品。

1.3.2 參豉發(fā)酵工藝優(yōu)選

以纖溶酶活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同菌株、黃豆與人參比例、人參加入方式、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間對(duì)纖溶酶活性的影響，確定最優(yōu)發(fā)酵工藝。

發(fā)酵菌株的篩選：黃豆與人參比例為10∶1（g∶g），人參加水提取，將菌株DC-1、GB-1、GB-2、GB-3、GB-4、DC-11和DC-1+DC-11復(fù)合菌分別作為發(fā)酵菌，其中菌株DC-1、GB-1、GB-2、GB-3、GB-4于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h；菌株DC-11和DC1+DC11復(fù)合菌于28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)120 h。

黃豆與人參比例的考察：調(diào)整黃豆與人參質(zhì)量比分別為50∶0、40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1作為發(fā)酵基質(zhì)，人參加水提取，以菌株DC-1為發(fā)酵菌，于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)48 h。

人參加入方式的考察：黃豆與人參的比例10∶1，人參以3種方式加入：（1）將黃豆加水浸泡后瀝干加入人參粉末拌勻；（2）將人參加蒸餾水煎煮2次，每次1 h，濾液浸泡黃豆；（3）先將人參用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇回流提取1 h，濾液回收乙醇，濾渣再加蒸餾水煎煮1 h，合并兩次濾液浸泡黃豆。以菌株DC-1為發(fā)酵菌，于37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h取樣，測(cè)定纖溶酶活性。

發(fā)酵溫度的考察：黃豆與人參質(zhì)量比10∶1，人參加水提取，以菌株DC-1為發(fā)酵菌，分別于25 ℃、28 ℃、33 ℃、37 ℃、40 ℃條件下恒溫培養(yǎng)96 h，測(cè)定纖溶酶活性。

1.3.3 纖溶酶活性的測(cè)定

參照王萍等[13]纖溶酶活性的測(cè)定方法制備纖維蛋白原平板和配制酶活力分別為80 IU/mL、60 IU/mL、40 IU/mL、20 IU/mL、10 IU/mL的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。取2 g樣品加0.9%氯化鈉溶液10 mL，研磨、過(guò)濾，分別取各樣品濾液及尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，點(diǎn)于纖維蛋白平板上，于37 ℃溫育18 h，測(cè)定溶圈面積。以尿激酶溶圈面積（y）為縱坐標(biāo)，酶活力（x）為橫坐標(biāo)，繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1.722 1x+9.255 9，R2=0.9906），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品的纖溶酶活性。

1.3.4 薄層色譜分析

供試品溶液的制備：參照《中國(guó)藥典》并稍作修改[4]。取最優(yōu)發(fā)酵工藝制備的參豉樣品干燥、粉碎，過(guò)3號(hào)篩，取10 g粉末（10 g參豉樣品相當(dāng)于含1 g人參），以同法處理的未接種發(fā)酵基質(zhì)為對(duì)照，分別加入三氯甲烷40 mL，加熱回流3 h，過(guò)濾，藥渣揮干溶劑，加水飽和的正丁醇50 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾。濾液加3倍體積的氨試液，搖勻，放置分層，收集上層溶液并蒸干，加入1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱取人參皂苷對(duì)照品Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh1、Rck，加甲醇，分別制成質(zhì)量濃度為2 g/L的對(duì)照品混合溶液。

采用薄層色譜法[4]，吸取上述人參皂苷對(duì)照品溶液和供試品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一薄層硅膠G板。以10 ℃以下放置的三氯甲烷-甲醇-水（65∶35∶10，V/V）下層溶液為展開(kāi)劑，于4 ℃展開(kāi)，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下觀察。

1.3.5 高效液相色譜分析

參照《中國(guó)藥典》對(duì)參豉中人參皂苷進(jìn)行定量分析[4]。采用甲醇將1.3.4中的對(duì)照品混合溶液稀釋10倍，得到質(zhì)量濃度為0.2 g/L的對(duì)照品溶液。以未接種發(fā)酵基質(zhì)為對(duì)照，取最優(yōu)發(fā)酵工藝制備的參豉樣品粉末10 g進(jìn)行HPLC分析。HPLC條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）和水（B），洗脫梯度為0～35 min，A為19%；35～55 min，A為19%～29%；55～70 min，A為29%；70～110 min，A為29%～40%。流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Graphpad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 參豉發(fā)酵工藝的確定

2.1.1 發(fā)酵菌株的篩選

不同發(fā)酵菌株對(duì)參豉纖溶酶活力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同菌株對(duì)參豉纖溶酶活性的影響Fig.1 Effect of different strains on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖1可知，不同菌株發(fā)酵參豉的纖溶酶活性大小排序?yàn)榫闐C-1＞GB-1＞DC-11+DC-11＞GB-3＞GB-2＞GB-4＞DC-11，其中枯草芽孢桿菌DC-1發(fā)酵參豉的纖溶酶活性最高，為（478.95±3.50）IU/g。已有研究表明，枯草芽孢桿菌為豆豉的主發(fā)酵菌，也是產(chǎn)豆豉纖溶酶的主要菌[14]。菌株DC-1和GB-1、GB-2、GB-3、GB-4雖均為枯草芽孢桿菌，但纖溶酶活性明顯存在差異（P＜0.05），說(shuō)明同一菌種不同菌株產(chǎn)纖溶酶能力存在差異。菌株DC-11為傘枝梨頭霉，在酒曲中普遍存在，可改善酒的風(fēng)味和口感[15]，該菌已用于人參皂苷、黃芪皂苷的微生物轉(zhuǎn)化[16-17]。由于淡豆豉傳統(tǒng)自然發(fā)酵為多菌種混合發(fā)酵而成，菌株DC-1和DC-11均分離自淡豆豉飲片，因此本研究中也利用這兩種菌復(fù)合菌發(fā)酵制備參豉進(jìn)行對(duì)比研究。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵菌株為DC-1。

2.1.2 黃豆與人參比例的確定

黃豆與人參比例對(duì)參豉纖溶酶活力的影響見(jiàn)圖2。

圖2 黃豆與人參比例對(duì)參豉纖溶酶活性的影響Fig.2 Effect of soybean to ginseng ratio on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖2可知，隨著人參加入量的升高，參豉纖溶酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)黃豆與人參比例為10∶1（g∶g）時(shí)，纖溶酶活性最高，為（495.02±19.24）IU/g。分析原因可能是人參在低質(zhì)量濃度時(shí)促進(jìn)而高質(zhì)量濃度時(shí)抑制菌株DC-1的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響纖溶酶活性。因此，確定黃豆與人參最佳比例為10∶1（g∶g）。

2.1.3 人參添加方式及發(fā)酵時(shí)間的確定

人參添加方式及發(fā)酵時(shí)間對(duì)參豉纖溶酶活力的影響見(jiàn)圖3。

圖3 人參添加方式及發(fā)酵時(shí)間對(duì)參豉纖溶酶活性的影響Fig.3 Effect of ginseng addition mode and fermentation time on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖3可知，人參以水提液和先醇提再水提的方式加入后發(fā)酵96 h時(shí)，纖溶酶活性均達(dá)到最高，分別為（492.95±36.25）IU/g和（498.07±35.12）IU/g，且優(yōu)于以粉末形式加入，從工藝過(guò)程考慮，人參采用水提液方式加入，發(fā)酵時(shí)間96 h。

2.1.4 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對(duì)參豉纖溶酶活力的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)參豉纖溶酶活性的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on fibrinolytic activities of ginseng-Douchi

由圖4可知，發(fā)酵溫度為25 ℃時(shí)，纖溶酶活力較低，分析原因可能是該菌生長(zhǎng)比較緩慢所致；發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，參豉纖溶酶活性最高，為（498.90±28.33）IU/g；發(fā)酵溫度高于28 ℃之后，纖溶酶活性呈下降趨勢(shì)，40 ℃時(shí)下降明顯，表明DC-1菌的生長(zhǎng)受溫度的影響較大，進(jìn)而影響酶的生物量。

綜上所述，以纖溶酶活性為考察指標(biāo)，確定參豉最佳發(fā)酵工藝：優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株為枯草芽孢桿菌DC-1，黃豆與人參比例為10∶1（g∶g），人參以水提液的方式加入，于28 ℃發(fā)酵96 h。

2.2 薄層色譜分析結(jié)果

《中國(guó)藥典》中僅以Rg1、Rf、Re、Rb1為對(duì)照進(jìn)行人參的鑒別[4]，本研究增加了稀有人參皂苷Rck、Rh1和Rc為對(duì)照品，為分析人參皂苷多種成分的轉(zhuǎn)化提供依據(jù)。7種人參皂苷的薄層色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 參豉中人參皂苷薄層色譜分析結(jié)果Fig.5 Result of ginsenoside in ginseng-Douchi analyzed by thin layer chromatogram

由圖5可知，7種人參皂苷對(duì)照品薄層色譜斑點(diǎn)分離度較好，表明該方法適用于這7種人參皂苷的分離。參豉發(fā)酵前后均含有7種人參皂苷，但發(fā)酵后人參皂苷Rh1和Rf斑點(diǎn)顏色變淡，可能是由于這兩種成分發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化。參豉發(fā)酵前后樣品的在Rc和Rb1斑點(diǎn)較密集，沒(méi)有明顯分開(kāi)，可能是由于大豆中的成分干擾所致，需結(jié)合高效液相色譜結(jié)果進(jìn)一步分析。

2.3 高效液相色譜結(jié)果

發(fā)酵前后參豉的HPLC見(jiàn)圖6，7種人參皂苷含量的變化見(jiàn)表1。

由圖6可知，除人參皂苷Rck在此色譜條件下未顯示單一的色譜峰外，其他6種人參皂苷對(duì)照品分離度均較好。由表1可知，未接種基質(zhì)中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rh1和Rc的含量分別為0.185 2 mg/g、0.355 8 mg/g、0119 8 mg/g、0.116 0 mg/g、0.071 6 mg/g和0.585 7 mg/g，發(fā)酵后分別為0.050 0 mg/g、0.095 5 mg/g、0.043 3 mg/g、0.039 0 mg/g、0.024 0 mg/g和0.156 0 mg/g，發(fā)酵后6種人參皂苷成分均下降60%以上，表明這6種成分在微生物酶作用下發(fā)生了生物轉(zhuǎn)化。未接種基質(zhì)在38.29 min出現(xiàn)一個(gè)色譜峰，但發(fā)酵后消失，且在36.98 min出現(xiàn)了一個(gè)新化合物，可能是此種成分轉(zhuǎn)化而得。除6種人參皂苷外，在80 min后也有幾種物質(zhì)峰面積下降，可能是其他人參皂苷成分發(fā)生了降解。目前已經(jīng)從人參屬植物中分離得到150多種人參皂苷[18]，《中國(guó)藥典》僅以人參皂苷Rg1、Re、Rb1三種對(duì)照品測(cè)定其含量，本研究又增加了Rf、Rh1和Rc對(duì)照品，但仍存在一定局限性，因?yàn)椴煌藚⒃碥盏慕Y(jié)構(gòu)不同，不能采用同一種方法把所有人參皂苷都提取分離并檢測(cè)出來(lái)。

圖6 人參皂苷對(duì)照品（A）及發(fā)酵前后參豉樣品（B）的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC of ginsenoside reference substance (A) and ginseng-Douchi (B) before and after fermentation

表1 參豉發(fā)酵前后6種人參皂苷含量的變化Table 1 Changes of 6 kinds of ginsenoside in ginseng-Douchi before and after fermentation

在已有報(bào)道中，人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化多以一種或幾種人參皂苷單體成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化[19-20]，不受其他基質(zhì)成分的干擾，更易于轉(zhuǎn)化成分的分析。參豉中人參的加入量?jī)H為黃豆質(zhì)量的1/10，在樣品制備及檢測(cè)過(guò)程中可能受黃豆中的一些成分干擾，且人參以水提液的方式加入，使人參皂苷成分不能完全提取出來(lái)，分析轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的成分相對(duì)也比較復(fù)雜。人參水提液中除含有人參皂苷外，人參多糖在降糖、增強(qiáng)免疫、抗氧化等方面也發(fā)揮了重要作用[21-22]。經(jīng)典名方“獨(dú)參湯”是以水煎液口服入藥，ZHOU S S等[23]研究表明，獨(dú)參湯可通過(guò)人參多糖對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用促進(jìn)人參皂苷的轉(zhuǎn)化；李瑞剛等[24]研究也證實(shí)人參多糖能促進(jìn)人參皂苷Re轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rg1。本研究?jī)H基于6種人參皂苷成分對(duì)參豉發(fā)酵前后人參皂苷的含量變化進(jìn)行分析，對(duì)于其他人參皂苷的轉(zhuǎn)化情況尚需通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究利用淡豆豉的發(fā)酵原理，將黃豆輔以人參發(fā)酵制備一種具有高纖溶活性的參豉。通過(guò)發(fā)酵菌株的篩選、人參的加入量和加入方式、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間的考察確定了參豉的最佳發(fā)酵工藝：優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株為枯草芽孢桿菌DC-1，黃豆與人參比例為10∶1（g∶g），人參以水提液的方式加入，于28 ℃發(fā)酵96 h。此優(yōu)化條件下參豉的纖溶酶活力達(dá)到（498.90±28.33）IU/g。同時(shí)，通過(guò)微生物發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了多種人參皂苷的體外生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)60%以上。本研究為參豉后續(xù)益氣活血作用研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)，也為開(kāi)發(fā)具有保健作用的食療產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。