趙晨婕 ，劉 念，王超凱，李 覓，孫中理，常少健，余 航，潘 明

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院，四川 成都 611130）

窖泥是固態(tài)濃香型白酒產(chǎn)酸呈味、產(chǎn)酯生香等微生物的棲息地，是釀造白酒風味的基礎[1-2]，富集了種類繁多、功能各異的釀酒微生物菌群[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，老窖中厭氧型細菌的種類及數(shù)量均多于新窖[5]，這些細菌對白酒中香味物質(zhì)的形成起著重要作用，是老窖產(chǎn)好酒的重要原因[6]。己酸菌是重要的窖泥產(chǎn)酸功能菌，其代謝產(chǎn)生的己酸與大曲發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇生成己酸乙酯[7-8]，形成濃香型大曲酒的主體香成分，決定著濃香型白酒的質(zhì)量及風格[9]。己酸菌的細胞形態(tài)有梭狀、短桿狀或長桿狀，分為專性厭氧、耐氧性和好氧性菌[10]。

1964年，輕工部茅臺試點組從窖泥中成功篩選出了己酸菌[11]，在此研究基礎上，1975年，內(nèi)蒙古輕工所采用純培養(yǎng)的方法也從老窖泥中篩選出了己酸菌，同時對己酸菌的培養(yǎng)方法進行了研究[12]。在己酸菌的生理代謝研究方面：沈怡方[13]經(jīng)過一系列試驗后發(fā)現(xiàn)，當培養(yǎng)基中缺乏乙醇時，易使丁酸的含量增加，若在培養(yǎng)基中增加淀粉類碳源時，易使己酸的含量降低，丁酸含量增加。在己酸菌培養(yǎng)的改進方面：杜禮泉等[14]使用不銹鋼罐培養(yǎng)、改進了培養(yǎng)基成分（去掉了鈣類物質(zhì)）；婁虹等[15]采用了固定化方法培養(yǎng)己酸菌；王瑞明等[16]采用絮凝技術提高了培養(yǎng)液中己酸菌的數(shù)量。杜禮泉等[17]解決了己酸菌在培養(yǎng)過程中發(fā)臭、變黑的問題。目前大多數(shù)酒廠多應用窖泥富集菌液改善酒質(zhì)，但在突出濃香型白酒的呈香風格上效果不明顯[13，18]，因此篩選出高產(chǎn)己酸的菌株具有極其重要的意義。

本研究通過對老窖泥多次富集培養(yǎng)從中篩選高產(chǎn)己酸的菌株，通過形態(tài)觀察及分子生物學技術對其進行鑒定，并對其中己酸生產(chǎn)能力最佳的一株己酸菌的發(fā)酵性能進行研究，為進一步的生產(chǎn)應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

老窖泥（1#、2#、3#）：某老酒廠優(yōu)質(zhì)大曲酒發(fā)酵池。

1.1.2 培養(yǎng)基

乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基[19]：乙酸鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸鎂0.02%，硫酸銨0.05%，酵母膏0.1%，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min，接種前加入無水乙醇2%。

平板篩選培養(yǎng)基[11]：乙酸鈉0.5%，磷酸氫二鉀0.04%，硫酸鎂0.02%，硫酸銨0.05%，酵母膏0.1%，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min，接種前加入碳酸鈣0.5%，無水乙醇2%以及0.1%溴百里酚藍指示劑1%。

1.1.3 試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-ZFD雙人單面潔凈工作臺：蘇州蘇潔凈化設備有限公司；MJX-250C立式恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備有限公司；LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ALC-1104電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；Agilent6820氣相色譜（gaschromatography，GC）儀：美國安捷倫公司；DHG-9071A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；722E可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；LEICA電子顯微鏡：德國LEICA公司；DK-98-II雙列八孔電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特有限公司；C1000 Touch聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國伯樂公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 富集培養(yǎng)

稱取某酒廠優(yōu)質(zhì)窖泥10 g于90 mL無菌水中，內(nèi)含有無菌玻璃珠，振蕩，使窖泥分散均勻成懸液。將樣品懸液在80 ℃水浴30 min，殺滅營養(yǎng)體及其他雜菌，富集芽孢。吸取熱處理后的懸液，以10%（V/V）的接種量加入乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，裝液量為200 mL，于37 ℃條件下培養(yǎng)7 d，連續(xù)富集4次后分別測定己酸含量。

1.3.2 產(chǎn)己酸菌的分離篩選

選取富集液中己酸含量最高的樣品梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，將稀釋后的菌懸液分別涂于平板篩選培養(yǎng)基上，每個梯度做三組平行，用封口膜封口后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d，篩選出黃色或黃綠色菌落。采用三區(qū)劃線法對得到的黃色菌落進行純化，得到單菌落[11]。

1.3.3 產(chǎn)己酸菌的鑒定

（1）形態(tài)觀察及己酸生產(chǎn)鑒定

對分離純化后得到的菌株進行形態(tài)觀察[13]，將菌株接種于乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下培養(yǎng)7 d后，利用氣相色譜法測定己酸含量，以鑒別是否屬于己酸菌。

（2）分子生物學鑒定

挑取單菌落于乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)3 d，10 000 r/min高速離心1 min，收集菌體沉淀。采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）PCR擴增細菌16SrDNA序列。PCR擴增體系：10×ExTaqbuffer2.0μL，ExTaq酶（5U）0.2 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）Mix 1.6μL，上下游引物各1 μL，模板0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）13.7 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，共25個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至美吉生物公司測序，將測序結果提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行同源性比對。

1.3.4 高產(chǎn)己酸菌發(fā)酵性能測試

生長曲線：將種子液（制備方法同1.3.1）按10%接種量接種于乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，每隔8～10 h取樣，采用可見分光光度計測定其OD600nm值，以未接種的培養(yǎng)基為空白樣，每個樣品重復三次。

發(fā)酵時間對菌株產(chǎn)己酸的影響：將種子液按10%接種量接種于乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)，每隔24 h取5 mL樣品，測定己酸含量，每個樣品重復三次。

初始pH值對菌株產(chǎn)己酸的影響：調(diào)節(jié)乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基的初始pH值為pH 2.0～12.0共11個梯度，將種子液按10%的接種量接種于乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，測定己酸含量，每個樣品重復三次。

乙醇對菌株產(chǎn)己酸的影響：在乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中分別加入0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的無水乙醇，將種子液按10%的接種量接種于乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，測定己酸的含量，每個樣品重復三次。

發(fā)酵溫度對菌株產(chǎn)己酸的影響：將種子液按10%的接種量接種于乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基中，分別在11～57 ℃（梯度為2 ℃）條件下培養(yǎng)7 d，測定己酸的含量，每個樣品重復三次。

1.3.5 己酸的測定

采用GC法測定己酸含量[20]。色譜柱為FFAP白酒分析專用色譜柱（50 m×0.25 mm×0.5 μm）；程序升溫：初始溫度47 ℃，保持5 min，以4.5 ℃/min的速率升溫至70 ℃，再以5 ℃/min的速率升溫至98 ℃，維持1 min，以5 ℃/min的速率升溫至145 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至190 ℃，以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持15 min；汽化室溫度250 ℃；檢測器溫度250 ℃；載氣為高純氮氣（N2），流速：3 mL/min；進樣量0.6 μL；分流比為1∶1。

2 結果與分析

2.1 老窖泥的富集培養(yǎng)

將老窖泥1#、2#、3#分別連續(xù)富集4次后，測定己酸含量，結果見圖1。

圖1 1#（A）、2#（B）及3#（C）老窖泥富集液中己酸含量Fig.1 Caproic acid content in enriched aged pit mud 1#(A)、2#(B) and 3#(C)

由圖1可知，在相同培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件下，3#老窖泥的己酸含量遠高于1#老窖泥和2#老窖泥，且隨著富集次數(shù)的增加，己酸含量增加，產(chǎn)己酸的穩(wěn)定性好，產(chǎn)酸能力強，故選擇3#老窖泥富集液作為篩選優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)己酸菌的菌源。

2.2 產(chǎn)己酸菌的篩選

通過平板篩選培養(yǎng)基篩選出3株產(chǎn)己酸細菌，編號為A-1、A-3、A-5，其形態(tài)觀察結果見圖2，具體描述見表1及表2。

由圖2、表1及表2可知，菌株A-1、A-3及A-5符合己酸菌的基本形態(tài)[5]，菌落呈白色圓形扁平狀，表面濕潤光滑，邊緣較規(guī)則，細胞形態(tài)呈桿狀，芽孢端生或近端生。

圖2 菌株A-1、A-3及A-5菌落形態(tài)（A、B、C）及細胞形態(tài)（D、E、F）Fig.2 Colony (A,B,C) and Cell (D,E,F) morphology of A-1，A-3 and A-5

表1 菌株的菌落形態(tài)Table 1 Colony morphology of strains

表2 菌株的細胞形態(tài)Table 2 Cell morphology of strains

2.3 篩選菌株的己酸生產(chǎn)鑒定

菌株A-1、A-3、A-5的己酸產(chǎn)量見圖3。由圖3可知，菌株A-1、A-3、A-5均能產(chǎn)己酸，且產(chǎn)量較高，分別為5.73 g/L、9.77 g/L、7.45 g/L，將其作為高產(chǎn)己酸菌進行進一步研究。

圖3 菌株A-1、A-2及A-3的己酸產(chǎn)量Fig.3 Caproic acid yield of strains A-1,A-2 and A-3

2.4 高產(chǎn)己酸菌的分子生物學鑒定

2.4.1 PCR擴增結果

菌株A-1、A-3及A-5的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖4。由圖4可知，菌株A-1、A-3及A-5的16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物堿基長度約為1 600 bp，與預期結果相符，送至美吉生物公司測序。

圖4 菌株A-1、A-2及A-3 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.4 Agarose gel electrophoresis result of PCR products of 16S rDNA of strains A-1,A-2 and A-3

2.4.2 同源性比對結果

將菌株A-1、A-3、A-5的測序結果在Genbank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對分析，結果見表3。

表3 序列同源性比對結果Table 3 Results of sequence homologous alignment

由表3可知，3株菌株與克魯維氏梭菌的同源性＞98%，表明3株菌均為克魯維氏梭菌（Clostridium kluyveri），根據(jù)己酸生產(chǎn)性能，選取己酸生產(chǎn)能力最高的菌株A-3進行發(fā)酵性能測試。

2.5 菌株A-3發(fā)酵性能測試結果

2.5.1 生長曲線

圖5 菌株A-3的生長曲線Fig.5 Growth curve of strain A-3

菌株A-3的生長曲線見圖5。由圖5可知，菌株A-3的延遲期為0～22 h，對數(shù)生長期為22～80 h，80 h后進入穩(wěn)定期。

2.5.2 發(fā)酵時間對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響

發(fā)酵時間對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響見圖6。由圖6可知，發(fā)酵過程中，菌株A-3的己酸產(chǎn)量呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢。發(fā)酵1～2 d時，己酸含量無明顯變化；發(fā)酵3～7 d，己酸含量明顯升高，己酸含量從1.44 g/L增加至6.10 g/L；發(fā)酵8～14 d，己酸含量從6.10 g/L增加至6.71 g/L，變化較小；發(fā)酵14 d后，己酸產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，終止發(fā)酵。

圖6 發(fā)酵時間對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響Fig.6 Effect of fermentation on caproic acid production by strain A-3

2.5.3 初始pH值對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響

初始pH值對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響見圖7。由圖7可知，隨著培養(yǎng)基初始pH值的升高，菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趨勢。當初始pH值為7.0時，己酸含量最高，為7.79 g/L，故菌株A-3產(chǎn)己酸的最適pH值為7.0，pH耐受范圍為3.0～11.0。

圖7 初始pH值對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響Fig.7 Effect of initial pH on caproic acid production by strain A-3

2.5.4 乙醇對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響

乙醇對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響見圖8。由圖8可知，隨著乙醇含量的增大，菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趨勢。當培養(yǎng)基中乙醇含量為2%時，己酸含量最高，為6.22 g/L。不添加乙醇時，菌株A-3不產(chǎn)己酸，表明乙醇是產(chǎn)己酸的必要條件之一。乙醇含量過高，對己酸菌有一定的抑制作用，其己酸含量顯著下降（P＜0.05）。當乙醇含量為6%時，發(fā)酵液中幾乎檢測不出己酸。故菌株A-3的最適乙醇含量為2%，乙醇最高耐受度為5%。

圖8 乙醇對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響Fig.8 Effect of ethanol on caproic acid production by strain A-3

2.5.5 發(fā)酵溫度對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響

發(fā)酵溫度對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響見圖9。由圖9可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，菌株A-3的己酸含量呈先升高后下降的趨勢。當發(fā)酵溫度為37 ℃時，己酸含量最高，為8.17 g/L。當發(fā)酵溫度低于11 ℃或高于57 ℃時，則幾乎不產(chǎn)己酸，故最適發(fā)酵溫度為37 ℃，溫度耐受范圍為13～55 ℃。

圖9 發(fā)酵溫度對菌株A-3產(chǎn)己酸的影響Fig.9 Effect of fermentation temperature on caproic acid production by strain A-3

3 結論

通過對老窖泥的多次富集培養(yǎng)，從3#老窖泥中篩選得到3株高產(chǎn)己酸的菌株A-1、A-3和A-5，己酸產(chǎn)量分別為5.73 g/L、9.77 g/L、7.45 g/L。通過形態(tài)觀察及分子生物學技術鑒定3株菌株均為克魯維氏梭菌（Clostridium kluyveri）。其中Clostridium kluyveriA-3己酸產(chǎn)量最高，對其發(fā)酵性能進行測定。結果表明，Clostridium kluyveriA-3在22 h后進入對數(shù)期，80 h后進入穩(wěn)定期，其產(chǎn)己酸的最佳初始pH值為7.0，發(fā)酵時間為14 d，發(fā)酵溫度為37 ℃，乙醇含量為2%，pH耐受范圍為3.0～11.0，乙醇最高耐受含量為5%，溫度耐受范圍為13～55 ℃。通過對高產(chǎn)己酸A-3菌株發(fā)酵性能的研究發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)酸性能極佳，發(fā)酵性能良好，可為進一步的生產(chǎn)應用奠定基礎。