顏 麗，劉秀河，李同樂(lè)

（齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東 濟(jì)南 250353）

中國(guó)酒曲歷史悠久，用曲釀酒是國(guó)內(nèi)白酒的特色之一，是固態(tài)發(fā)酵蒸餾酒的重要保障，其中包含大量不同的菌系及其產(chǎn)生的多種酶類(lèi)。現(xiàn)代研究表明，白酒酒體中所含有的物質(zhì)組成十分復(fù)雜，其中98%～99%約為乙醇水溶液，1%～2%為各種香味成分[1]。而正是這含量很低的香味成分決定了白酒品質(zhì)的優(yōu)劣。在眾多的香味成分中，酯類(lèi)物質(zhì)對(duì)白酒風(fēng)味起重要作用，如濃香型白酒（五糧液）的主要香味物質(zhì)是己酸乙酯、清香型白酒（汾酒）主要香味物質(zhì)為乙酸乙酯和乳酸乙酯[2]。

一般而言，酯類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生主要有兩種途徑，一種是微生物在代謝過(guò)程中本身產(chǎn)生酯類(lèi)物質(zhì)，另一種重要途徑是在發(fā)酵過(guò)程中各種微生物產(chǎn)生的酯化酶將周?chē)h(huán)境中的有機(jī)酸和醇類(lèi)催化合成酯類(lèi)物質(zhì)[3]。酯化酶產(chǎn)生菌是具有酸醇酯化能力特殊功能的特定微生物，酯化酶產(chǎn)生菌大多為真菌，研究表明，將酯化力高的菌種運(yùn)用在白酒中，可以明顯提高白酒質(zhì)量，使口感醇厚，香味濃郁。孫曉璐等[4]以中溫大曲為原料，篩選出了產(chǎn)酯化酶犁頭霉（Absidia orchidis），其酯化力達(dá)到9.32 g/L；周榆林等[5]從郎酒酒糟中篩選得到了1株耐酸產(chǎn)酯香枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ZP-28；宮若楠等[6]從衡水老白干酒大曲中分離篩選得到1株高酯化力毛霉8號(hào)，最高酯化力為263.55 mg/g麩曲（以乙酸乙酯計(jì)）。但是目前，由于環(huán)境和地域差異，篩選出的菌株不利于全國(guó)性推廣使用。因此，高酯化力菌株的篩選具有重要的意義。

本研究以酯化力最高的梁山大曲為原料，酯化力為考察指標(biāo)，從中篩選高酯化力菌株，并通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)及分子生物學(xué)試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行鑒定，為其在優(yōu)質(zhì)酒的領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

中溫大曲（1#、2#）、中高溫大曲（1#、2#）：山東梁山徐坊大曲有限公司。

蛋白胨、酵母膏、牛肉膏（均為生化試劑）：北京奧博星科技有限公司；氯霉素（純度99%）、氨芐青霉素（純度98%）：上海索寶來(lái)生物科技有限公司；制霉菌素（純度97%）、脫氧膽酸鈉（純度98%）：羅恩試劑有限公司；三丁酸甘油酯（純度95%）、乳酸石炭酸染液（純度99%）：上海阿拉丁試劑有限公司；3%聚乙烯醇（分析純）：國(guó)貿(mào)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Ezup柱式真菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌培養(yǎng)基[7]：牛肉膏3%，蛋白胨10%，氯化鈉5%，瓊脂20%，蒸餾水1 000 mL，三丁酸甘油酯0.4%，制霉菌素25 μg/mL，pH 7.0～7.2。

酵母培養(yǎng)基[8]：酵母粉10%，蛋白胨20%，葡萄糖20%，氨芐青霉素50 μg/mL，瓊脂2%，三丁酸甘油酯0.4%，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[9]：馬鈴薯20%、蔗糖2%、瓊脂2%、三丁酸甘油酯0.4%，氯霉素25μg/mL，蒸餾水1000mL，自然pH值，脫氧膽酸鈉1mg/mL。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮15 g，蒸餾水21 mL。

初篩培養(yǎng)基[10]：三丁酸甘油酯乳化液20%，蒸餾水980 mL，瓊脂20%。

3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液[11]：將3%聚乙烯醇與三丁酸甘油酯以體積比4∶1的比例在高速勻漿機(jī)處理9 min。

查氏酵母膏瓊脂（czapek yeast extract agar，CYA）培養(yǎng)基[12]：磷酸氫二鉀1‰，硝酸鈉3‰，氯化鉀0.5‰，硫酸鎂0.2‰，七水合硫酸亞鐵0.01‰，酵母提取物5‰，蔗糖3%，瓊脂1.5%，蒸餾水1 000 mL。

25%甘油硝酸鹽瓊脂（25%glycerol nitrate agar，G25N）培養(yǎng)基[13]：磷酸氫二鉀1‰，硝酸鈉3‰，氯化鉀0.5‰，硫酸鎂0.2‰，七水合硫酸亞鐵0.01‰，酵母提取物5‰，蔗糖3%，瓊脂1.5%，甘油25%，蒸餾水750 mL。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為121 ℃、20 min，抗生素均為滅菌后倒平板前加入。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2G無(wú)菌操作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HNY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；Gzone5F抑菌圈及菌落計(jì)數(shù)測(cè)量?jī)x：杭州訊數(shù)科技有限公司；XSP-2CA雙目顯微鏡：上海光學(xué)儀器廠；Verity 96well聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：生工生物工程（上海）有限公司；牛津杯：上海申源科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大曲水分含量及酯化力的測(cè)定

分別取中溫大曲（1#、2#）、中高溫大曲（1#、2#）各2塊，首先，將大曲置于101～105 ℃烘干，根據(jù)烘干前后質(zhì)量差，計(jì)算出水分含量。然后，參照輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]測(cè)定其酯化力，選取酯化力高的大曲進(jìn)行菌株的篩選。

1.3.2 高酯化力菌種的分離純化取曲粉2 g，加入18 mL無(wú)菌水，30 ℃、200 r/min條件下振蕩2 h，靜置30 min。吸取0.5 mL曲液到4.5 mL無(wú)菌水中進(jìn)行稀釋，按10倍系列梯度稀釋至10-5，吸取200 μL稀釋度為10-3～10-5的稀釋曲液，均勻涂布于3種固體培養(yǎng)基（細(xì)菌培養(yǎng)基、酵母培養(yǎng)基、PDA，每種培養(yǎng)基做3個(gè)平行）中，細(xì)菌置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h，酵母置于28 ℃培養(yǎng)48 h，霉菌置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d。從長(zhǎng)好的平板上挑取不同的菌落于相應(yīng)平板上分離后，再進(jìn)行多次純化，直至平板培養(yǎng)基上為單菌落。

1.3.3 高酯化力菌種的篩選

（1）初篩

從平板上挑取一環(huán)生長(zhǎng)良好的菌種（細(xì)菌和酵母）接入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基試管中，于相應(yīng)溫度、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，即為粗酶制劑，霉菌直接制作孢子懸浮液即可。于初篩培養(yǎng)基中放入3～4個(gè)牛津杯，分別取粗酶制劑100 μL加入牛津杯中，于相應(yīng)的溫度下培養(yǎng)，觀察孔周?chē)欠駮?huì)有透明圈以及透明圈的大小，用抑菌圈測(cè)量?jī)x測(cè)出透明圈直徑（D）及菌落直徑（d），計(jì)算D/d值。選擇D/d值大的菌株進(jìn)一步復(fù)篩。

（2）復(fù)篩

將初篩獲得的菌株制成孢子懸浮液（5.7×107個(gè)/mL），將孢子懸浮液以10%（V/V）接種量接入基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)6～7 d，于35～40 ℃的烘箱中烘干，粉碎，保存?zhèn)溆?。? g菌粉，參照QB/T 5188—2017《釀造紅曲》[15]測(cè)定菌株的酯化力。

1.3.4 高酯化力菌種的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)鑒定

菌落形態(tài)觀察：采用點(diǎn)種法將菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基、CYA培養(yǎng)基和G25N培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4 d，每天觀察菌落的顏色、形狀、菌絲情況。顯微形態(tài)觀察：在載玻片上滴加一滴生理鹽水，用接種針挑取少量菌絲置于生理鹽水中，緩慢烘干，滴加一滴乳酸石炭酸棉蘭染液，染色2 min，蓋上蓋玻片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的菌絲結(jié)構(gòu)、孢子、閉囊殼與子囊孢子的大小。

（2）生理生化鑒定

碳源同化實(shí)驗(yàn)[16]：分別采用麥芽糖、果糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖替代PDA培養(yǎng)基中的葡萄糖，取100 μL孢子懸浮液接種于平板中，30℃條件下培養(yǎng)3～4d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

氮源同化實(shí)驗(yàn)[16]：分別采用牛肉膏、酵母粉、尿素、豆粉、亞硝酸鉀和硫脲替代PDA培養(yǎng)基中的蛋白胨，取100 μL孢子懸浮液接種于平板中，30 ℃條件下培養(yǎng)3～4 d，觀察菌株的生長(zhǎng)狀況。

耐酸性實(shí)驗(yàn)[17]：分別調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值為4、5、6、7、8、9、10、11，取100 μL孢子懸浮液接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)3～4 d，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。

耐乙醇實(shí)驗(yàn)[18]：在PDA培養(yǎng)基中分別加入3%、6%、9%、12%、15%、18%的無(wú)水乙醇，取100μL孢子懸浮液接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃條件下培養(yǎng)3～4 d，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。

（3）分子生物學(xué)鑒定

用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株的DNA，以其為模板，采用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（各2.5mmol/L）1.0μL，DNA聚合酶0.2μL，上下游引物各0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工生物有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株的ITS序列，利用MEGA7軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲酯化力和含水量測(cè)定結(jié)果

中溫、中高溫大曲的含水量及酯化力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 大曲酯化力和含水量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of esterification power and moisture of Daqu

由表1可知，中溫大曲2#的含水量（12.30±0.23）%及酯化力（712.8±0.68）U均最高，因此，選擇中溫大曲2#為目標(biāo)大曲。

2.2 大曲中高酯化力菌株的篩選

2.2.1 初篩

通過(guò)分離純化后，從中溫大曲2#中初步分離出3株細(xì)菌（X1～X3）、1株酵母（J1）、6株霉菌（Z1～Z6）。以三丁酸甘油酯為底物對(duì)菌株進(jìn)行初篩，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 高酯化力菌株初篩結(jié)果Table 2 Preliminary screening results of strain with high esterification power

續(xù)表

由表2可知，10株菌株的D/d值為1.555～2.686，均具有水解三丁酸甘油酯的能力，其中，霉菌的D/d值最大，選取其中D/d值較大的5株霉菌（Z1、Z2、Z3、Z4、Z6）進(jìn)行復(fù)篩。

2.2.2 復(fù)篩

菌株Z1、Z2、Z3、Z4、Z6的酯化力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 高酯化力菌株復(fù)篩結(jié)果Table 3 Secondary screening results of strain with high esterification power

由表3可知，菌株Z1的酯化力最高為66.943 mg/g·100 h，且高于QB/T 5188—2017《釀造紅曲》規(guī)定的30 mg/g·100 h。因此，選定該菌株為目標(biāo)菌株進(jìn)行菌種鑒定，并編號(hào)為YL-1。

2.3 菌株YL-1的鑒定

2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

（1）個(gè)體形態(tài)觀察

菌株YL-1在PDA培養(yǎng)基、CYA培養(yǎng)基和G25N培養(yǎng)基上的菌落及菌絲形態(tài)見(jiàn)表4。

表4 菌株YL-1的菌落形態(tài)特征Table 4 Colony morphological characteristics of strain YL-1

由表4可知，菌株YL-1在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛，菌絲濃密呈現(xiàn)白色；菌落平坦，呈圓形，直徑可達(dá)到5 cm，在PDA培養(yǎng)基表面和背面呈現(xiàn)橙黃色，CYA培養(yǎng)基表面和背面呈橙紅色，G25N培養(yǎng)基表面呈白色。菌株的菌絲有橫隔、分枝，內(nèi)含有多核，孢子主要生長(zhǎng)在菌絲的頂端，閉囊殼呈球形，且閉囊殼內(nèi)還有許多子囊，子囊也呈現(xiàn)為球形。結(jié)合《菌種鑒定手冊(cè)》[21]初步判斷該菌株為紅曲霉（Monascus）。

2.3.2 生理生化鑒定

（1）碳氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株YL-1的碳氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，菌株YL-1可利用果糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、阿拉伯糖、葡萄糖，且對(duì)麥芽糖和葡萄糖的利用效果最好。菌株YL-1可利用牛肉膏、酵母粉、豆粉等有機(jī)氮源以及尿素，但不能利用硫脲、亞硝酸鉀等無(wú)機(jī)氮源。

表5 菌株YL-1碳氮源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of carbon and nitrogen source assimilation experiments of strain YL-1

（2）耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株YL-1的耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，菌株YL-1具有一定的耐酸能力，在pH為4時(shí)生長(zhǎng)狀況良好，這與紅曲霉嗜酸性一致[22]，可判定該菌株為紅曲霉（Monascus）。

表6 菌株YL-1耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of acid tolerance experiments of strain YL-1

（3）耐乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果

菌株YL-1的耐乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，菌株YL-1耐乙醇能力非常高，可在15%的乙醇含量下生長(zhǎng)。

表7 菌株YL-1耐乙醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of ethanol tolerance experiments of strain YL-1

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定

菌株YL-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

圖1 基于ITS基因序列菌株YL-1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strain YL-1 based on ITS gene sequences

由圖1可知，菌株YL-1與叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）CBS 286.34（MH855520.1）及紅色紅曲霉（Monascus ruber）CGMCC 3.4701（MK359688.1）聚于一支，親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定與生理生化鑒定，鑒定該菌株為叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以梁山中溫大曲為原料，篩選得到一株酯化力高的菌株YL-1，酯化力為66.94 mg/g·100 h，遠(yuǎn)高于輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5188—2017《釀造紅曲》中規(guī)定的酯化力（30 mg/g·100 h）。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）。