張 琪，朱立斌，朱 丹，苗欣月，牛廣財 *，魏文毅

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

黑加侖（Ribes nigrumL.）學(xué)名黑穗醋栗，俗稱黑豆果或紫梅[1]，屬虎耳草科茶藨子屬，多年生小型灌木植物[2]。果實為球狀黑色，味道酸甜可口，主要分布在新疆阿勒泰、伊犁河谷、黑龍江及遼寧等地區(qū)[3]。黑加侖果實含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如有機酸、維生素、黃酮類物質(zhì)、礦物質(zhì)、生物類黃酮、花青素、酚類物質(zhì)[4-5]、多糖等生物活性物質(zhì)。其中維生素C含量特別高；鮮果中花青素含量可達到90 mg/100 g，花色苷含量可達172 mg/100 g[2]。因此，黑加侖可預(yù)防心腦血管疾病，改善視力，具有提高免疫力、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓等功效[6-12]。所以，黑加侖有很大的市場價值和開發(fā)潛力，黑加侖產(chǎn)品以果汁和果酒為主。

以新鮮黑加侖果為原料，經(jīng)過酵母菌發(fā)酵而成的低度果酒很受消費者歡迎。黑加侖果酒在發(fā)酵過程中，還原糖含量的下降、酵母菌數(shù)目的生長以及酒精度的變化都有一定的規(guī)律。發(fā)酵動力學(xué)是對微生物生長和產(chǎn)物形成過程的定量描述，研究發(fā)酵過程中菌體的生長、底物消耗和產(chǎn)物合成之間的動態(tài)平衡及內(nèi)在規(guī)律。果酒發(fā)酵動力學(xué)主要研究菌體數(shù)目的變化、糖的消耗以及酒精度的生成情況。目前，關(guān)于發(fā)酵動力學(xué)的研究較多，如李敏杰等[13]對蓮霧果酒發(fā)酵過程中酵母菌的數(shù)量、酒精度、總糖含量隨時間的變化情況進行非線性擬合，其擬合度R2分別為0.949、0.979、0.997，能較好反映蓮霧果酒發(fā)酵過程中各項指標的變化情況；張琪等[14]對沙棘果酒發(fā)酵過程中酵母菌的數(shù)量、酒精度、總糖含量隨時間的變化情況進行非線性擬合，擬合度均＞0.95，為沙棘果酒發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。李雪等[15]使用Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型進行了非線性擬合，3種模型的預(yù)測值和測量值的擬合值均＞0.99。靳夢楚等[16]采用Logistic和DoseResp模型對紅心火龍果果酒不同發(fā)酵時期的酵母菌數(shù)目、酒精度、殘?zhí)橇窟M行非線性擬合，擬合度均＞0.99，能較好地描述發(fā)酵中的動力學(xué)特征。這些模型均具有良好的擬合效果，可以很好的反映出果酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量，酒精含量和糖的含量的動態(tài)變化，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

本試驗擬采用經(jīng)典的Logistic模型、SGompertz模型和Dose Resp模型和Boltzmann模型，對黑加侖果酒發(fā)酵過程中酵母數(shù)量的變化、酒精生成和還原糖消耗情況進行非線性擬合，建立發(fā)酵動力學(xué)模型，通過對黑加侖果酒發(fā)酵動力學(xué)的研究，可以為控制黑加侖果酒的發(fā)酵生產(chǎn)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑加侖果（可溶性固形物含量12%）：購于黑龍江省農(nóng)科院漿果研究所；RV171型葡萄酒活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；白砂糖（食品級）：黑龍江北方糖業(yè)股份有限公司；Pectinex XXL果膠酶（酶活10 000 U/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；3,5-二硝基水楊酸、福林酚（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；偏重亞硫酸鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

WS108手持式折光儀：河北潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司；HR7633打漿機：飛利浦家庭電器（珠海）有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽：上海森信實驗儀器有限公司；UV-1100紫外可見分光光度計：上海凌析儀器有限公司；L420臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱；YS100尼康生物顯微鏡：日本尼康公司；EX324電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑加侖果酒發(fā)酵工藝流程與操作要點

黑加侖果→挑選→打漿→酶解→調(diào)整糖度→殺菌→接種→恒溫發(fā)酵→黑加侖果酒

操作要點：

取一定量的黑加侖果，用打漿機打漿，測其可溶性固形物的含量[17]。用果膠酶進行酶解，酶解溫度為45～50 ℃，酶解時間3 h[18]。加入白砂糖調(diào)整果漿糖度至21°Bx，加入40 mg/kg的SO2，并冷卻至室溫。取一定量的干酵母，溶于其10倍體積的黑加侖汁和蒸餾水（兩者體積比為1∶2）中，在35 ℃條件下將酵母菌活化30 min。接種前在60 ℃條件下殺菌30 min，然后冷卻至室溫，接入5%活化好的酵母菌，于21 ℃條件下恒溫發(fā)酵一定時間，得到黑加侖果酒。

1.3.2 發(fā)酵動力學(xué)主要指標的測定方法

（1）酵母菌數(shù)量：將發(fā)酵液取出用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)，滴于血球計數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下直接計數(shù)。

（2）還原糖含量測定：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖的質(zhì)量濃度[19]。葡萄糖標準曲線回歸方程：y=0.538 9x-0.016 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 2。

（3）酒精度測定：采用先蒸餾，然后用密度瓶法測定黑加侖果酒的酒精度[20]。

（4）可溶性固形物測定：取少量液體樣品，置于手持式折光儀上，進行讀數(shù)。

1.3.3 動力學(xué)模型建立方法

酵母菌生長動力學(xué)模型擬合：采用典型的“S”曲線模型：通過非線性擬合Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型，并對三種模型擬合程度進行比較。相關(guān)系數(shù)（R2）越大，擬合度越高，最后選擇相關(guān)系數(shù)最大的模型來描述[15]。

酒精生成動力學(xué)模型擬合：在酵母菌生長的過程中會利用還原糖產(chǎn)生酒精，所以酒精的生成與酵母的生長有著直接的關(guān)系，屬于生長“耦聯(lián)”型。所以選擇“S”型曲線：Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型進行擬合，選取相關(guān)系數(shù)最大的模型描述酒精度的變化。

還原糖含量動力學(xué)模型擬合：在黑加侖果酒的發(fā)酵過程中，還原糖主要用于生產(chǎn)酒精。選用經(jīng)典模型中的Logistic模型、Botlzman模型與DoseResp模型進行非線性擬合，擬合后選取相關(guān)系數(shù)最大的模型描述還原糖含量的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑加侖果酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)量、酒精度以及還原糖含量的變化

圖1 黑加侖果酒發(fā)酵過程中酒精度、酵母菌數(shù)、還原糖含量變化Fig.1 Changes of alcohol content,yeast count and reducing sugar content during the fermentation of blackcurrant fruit wine

由圖1可知，發(fā)酵初期，24 h之前酵母菌生長較緩慢，該過程酵母菌代謝系統(tǒng)適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境，表現(xiàn)為菌體數(shù)量增加較慢；果酒發(fā)酵24 h后，酵母菌進入指數(shù)生長期，在短暫適應(yīng)期后，糖分被菌體快速消耗，菌體數(shù)量以幾何級數(shù)增長；發(fā)酵到達144 h后，由于體系基質(zhì)消耗殆盡，代謝產(chǎn)生的酒精積累在一定程度上也抑制菌體生長[21]，菌體生長進入穩(wěn)定期，酵母菌數(shù)量最高達1.035×108CFU/mL。酵母菌利用還原糖代謝產(chǎn)生酒精，發(fā)酵過程中，前24 h酒精度變化緩慢，酒精度0.15%vol左右，這與酵母適應(yīng)新環(huán)境和氧氣濃度較高有關(guān)，隨著酵母菌指數(shù)生長期即在24～96 h呈快速增長趨勢；此時酵母菌迅速繁殖，并消耗還原糖，144 h后，酒精度的增加也比較緩慢，在240 h，黑加侖酒的酒精含量最高，達到10.61%vol。

發(fā)酵體系的還原糖含量隨著發(fā)酵時間的增加而降低，為酵母菌代謝提供所需能量，還原糖逐漸被代謝生成酒精。在發(fā)酵24～96 h，體系還原糖含量迅速下降；144 h后，酵母菌數(shù)量與酒精度增長緩慢的同時，還原糖含量也緩慢下降，240 h時還原糖含量下降至1.99 g/L，發(fā)酵結(jié)束。

2.2 酵母菌的生長動力學(xué)模型

酵母菌數(shù)的不同模型下的擬合方程及相關(guān)系數(shù)見表1。由表1可知，對Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型的擬合相關(guān)系進行了比較后可以得出：不同模型中擬合方程的R2值沒有顯著性差異，Logistic模型的擬合效果較好，擬合相關(guān)系數(shù)R2為0.986 45。因此，實驗中使用Logistic模型來擬合黑加侖酒中的酵母生長，酵母菌數(shù)量的實際值和擬合曲線見圖2。由圖2可知，酵母菌經(jīng)過一段時間的適應(yīng)期，在黑加侖果酒發(fā)酵24 h后生長速率開始提高，24～96 h酵母菌為對數(shù)生長，144 h后，酵母幾乎不再生長，趨于平穩(wěn)，進入穩(wěn)定期。

表1 酵母菌數(shù)的擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 1 Fitting equation of yeast count and its correlation coefficients

圖2 Logistic模型（A）及實測值（B）下酵母菌生長擬合曲線Fig.2 Fitting curves of yeast growth under the Logistic model (A) and measured value (B)

2.3 酒精度動力學(xué)模型

Logistic模型、SGompertz模型和DoseResp模型對酒精度的擬合方程以及相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，擬合相關(guān)系數(shù)分別是0.997 69、0.997 24、0.99 42。不同模型中擬合方程的R2值沒有顯著性差異，其中，Logistic模型的擬合相關(guān)系數(shù)R2略高，為0.997 69，表明該模型可以較好地描述黑加侖果酒發(fā)酵過程中酒精度的變化。因此，本實驗選擇Logistic模型來擬合產(chǎn)物生成曲線，其擬合曲線見圖3。由圖3可知，酒精度在192 h后趨于平緩，最大值為10.61%vol。

表2 酒精生成擬合方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Fitting equation and correlation coefficient of alcohol formation

圖3 Logistic模型（A）及實測值（B）下酒精度的擬合曲線Fig.3 Fitting curves of alcohol under Logistic model (A) and measured value (B)

2.4 還原糖含量動力學(xué)模型

DoseResp模型、Logistic模型和Boltzmann模型對還原糖含量的擬合方程及相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，不同模型中擬合方程的R2值沒有顯著性差異，Logistic模型擬合效果較好，擬合相關(guān)系數(shù)R2為0.996 22。該模型能夠較好地反映黑加侖果酒發(fā)酵過程還原糖含量的變化。因此，選用Logistic模型擬合基質(zhì)消耗過程，結(jié)果見圖4。由圖4可知，發(fā)酵前96 h，還原糖消耗速度逐漸增大，在144 h后，酵母菌數(shù)目和酒精度的變化趨于穩(wěn)定，殘?zhí)橇肯陆邓俣纫仓饾u變緩；發(fā)酵216 h時，還原糖含量降到2.059 g/L，這也標志著發(fā)酵結(jié)束。因此，實際生產(chǎn)中，可通過檢測黑加侖發(fā)酵果酒體系中的還原糖含量，來判斷果酒的發(fā)酵是否結(jié)束[22]。

表3 還原糖含量的擬合方程及其相關(guān)系數(shù)Table 3 Fitting equation of reducing sugar content and its correlation coefficient

圖4 Logistic模型（A）及實測值（B）下還原糖消耗擬合曲線Fig.4 Fitting curves of reducing sugar consumption under the Logistic model (A) and measured value (B)

3 結(jié)論

通過對黑加侖果酒發(fā)酵過程中酵母菌數(shù)、還原糖含量和酒精含量分別進行數(shù)據(jù)分析，Logistic模型，DoseResp模型，Boltzmann模型和SGompertz模型等發(fā)酵動力學(xué)經(jīng)典模型對黑加侖果酒發(fā)酵均呈現(xiàn)較好的擬合效果，上述模型均能很好的描述黑加侖果酒發(fā)酵動力學(xué)特征，可以對其發(fā)酵過程進行定量分析和對實驗最終指標進行預(yù)測。