梁 楷，閆裕峰*，郎繁繁，周景麗，夏瑤瑤，張旭姣，丁 偉，武耀文

（山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400）

我國(guó)是世界上谷物釀醋最早的國(guó)家[1]，北魏賈思勰所著的《齊民要術(shù)》總結(jié)了當(dāng)時(shí)生產(chǎn)食醋的技術(shù)方法多達(dá)24種，每一種都各有特點(diǎn)[2]。谷物釀造食醋含有豐富的有機(jī)酸、糖類、游離氨基酸和香氣成分[3]，具有調(diào)節(jié)血脂、降低甘油三酯等獨(dú)特功效[4]。谷物釀造食醋總酸包括揮發(fā)酸和不揮發(fā)酸兩大類，其中揮發(fā)酸是食醋酸味的主要來(lái)源，其主要成分是乙酸；另外，食醋中還包含乳酸、蘋果酸和酒石酸等不揮發(fā)酸，能夠?qū)κ炒姿嵛哆M(jìn)行調(diào)和，增加食醋的柔和感[5]，因此食醋總酸含量是評(píng)價(jià)食醋品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[6]，目前生產(chǎn)上主要采用電位滴定法測(cè)定[7]，該法受人為因素影響較大，不能滿足現(xiàn)代食醋企業(yè)快速、在線檢測(cè)的生產(chǎn)需求，同時(shí)為了滿足生產(chǎn)檢測(cè)任務(wù)，企業(yè)需要配備多個(gè)檢測(cè)人員[8]，無(wú)形中增加企業(yè)檢測(cè)費(fèi)用。如何在食醋生產(chǎn)過(guò)程中，快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的檢測(cè)食醋總酸含量，降低生產(chǎn)成本，對(duì)規(guī)模化食醋生產(chǎn)企業(yè)具有重要的意義。

近紅外光譜（near-infrared spectroscopy，NIRS）分析技術(shù)依靠模型庫(kù)對(duì)被分析樣品進(jìn)行判別分析，建模時(shí)所需代表性的樣品數(shù)量少，不但分析快速、測(cè)樣時(shí)無(wú)損、還能在線及時(shí)反饋，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者在此方面開(kāi)展了一些研究工作，被廣泛用于食品、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的定性和定量檢測(cè)[9-12]。近紅外光譜分析方法主要應(yīng)用于含氫基團(tuán)（X-H）有機(jī)物質(zhì)的檢測(cè)[13]，食醋中有機(jī)酸含量豐富，均有大量含氫基團(tuán)，可使用近紅外方法進(jìn)行定量分析，故近紅外技術(shù)是食醋總酸快速檢測(cè)的一種理想分析技術(shù)。

本研究以紫林食醋作為實(shí)驗(yàn)材料，采用傅立葉變換近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合電位滴定法檢測(cè)食醋總酸含量，用偏最小二乘法（partial least-square，PLS）選擇最優(yōu)光譜模型[14-15]，預(yù)測(cè)未知食醋樣品的總酸。該方法極大的提高了檢測(cè)效率，為食醋工業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展與形成食醋生產(chǎn)的在線快速檢測(cè)技術(shù)提供依據(jù)，對(duì)于食醋生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)步和產(chǎn)品質(zhì)量升級(jí)具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食醋：山西紫林醋業(yè)股份有限公司；氫氧化鈉、酚酞（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

78-1型磁力加熱攪拌器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；AR124CN電子分析天平：奧豪斯科技有限公司；QuasIR3000傅里葉變換近紅外光譜儀：四川威斯派克科技有限公司（VSPEC）；實(shí)驗(yàn)室ST3100 pH計(jì)：常州榮華儀器制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣本的收集

本研究實(shí)驗(yàn)過(guò)程所用的食醋樣品均由工作人員從不同庫(kù)房隨機(jī)抽取不同酸度的樣品作為待測(cè)樣，其中總酸含量介于3.5～4.5 g/100 mL的樣品有21個(gè)，介于4.5～5.0 g/100 mL的樣品有71個(gè)，大于5.0 g/100 mL的樣品有14個(gè)，共計(jì)106個(gè)樣品，其中91個(gè)用于食醋總酸近紅外光譜采集和模型建立，剩余15個(gè)作為外部驗(yàn)證預(yù)測(cè)樣不參與建模。食醋總酸的測(cè)定參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》采用電位滴定法，每個(gè)樣品進(jìn)行3組平行測(cè)定，3組平行測(cè)定的相對(duì)誤差控制在1.0%以內(nèi)。

1.3.2 近紅外光譜采集

樣本近紅外光譜的采集，以蒸餾水為參比，將食醋樣品注入直徑為5 cm的石英玻璃樣品杯內(nèi)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。為避免樣品間交叉污染，保證樣品光譜質(zhì)量，每次將食醋樣品倒入樣品杯前使用清水沖洗樣品杯，并在潤(rùn)洗后將樣品杯中的水擦拭干凈，保持環(huán)境溫度為20 ℃，選擇漫反射積分球，測(cè)定樣品漫反射吸收光譜，掃描光譜范圍10 000～4 000 cm-1，光譜采集分辨率8 cm-1，掃描次數(shù)64次，用NirNet軟件對(duì)食醋樣品進(jìn)行光譜采集及分析，且每個(gè)樣品平行測(cè)定兩次，采集兩張平行光譜，最終取平均光譜圖作為最終分析圖譜。

1.3.3 近紅外模型建立

（1）光譜數(shù)據(jù)處理

利用VSPEC公司開(kāi)發(fā)的VModel近紅外建模軟件，采用多元散射校正對(duì)食醋總酸光譜進(jìn)行處理，消除由于應(yīng)用漫反射光譜采集時(shí)，帶來(lái)的光程無(wú)法保持恒定、樣品均勻性不一致等因素帶來(lái)的干擾[16]，同時(shí)應(yīng)用平滑、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)等預(yù)處理方法處理樣品的光譜數(shù)據(jù)，從而消除光譜采集時(shí)可能產(chǎn)生的噪聲影響[17]。另外，通過(guò)VModel近紅外建模軟件根據(jù)光譜的分布差異鑒別問(wèn)題樣品，直接剔除異常樣品，從而提高校正模型的適應(yīng)性和穩(wěn)定性[18]。

（2）建立模型及預(yù)測(cè)評(píng)估

為了科學(xué)而合理地對(duì)建立食醋總酸的近紅外模型的預(yù)測(cè)精度和模型穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，本次試驗(yàn)利用VSPEC公司開(kāi)發(fā)的VModel近紅外建模軟件，將食醋總酸作為近紅外定量模型參考值，采用偏最小二乘算法，結(jié)合不同光譜預(yù)處理方法和近紅外譜區(qū)，建立食醋總酸近紅外定量模型，采用決定系數(shù)R2、交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean square error ofcrossvalidation，RMSECV）和預(yù)測(cè)集均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)模型進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)分析，指標(biāo)計(jì)算公式如（1）～（3）。在樣品化學(xué)成分范圍相同的前提下，R2越接近1，交互驗(yàn)證均方根誤差和預(yù)測(cè)集均方根誤差越小時(shí)，模型的預(yù)測(cè)能力越強(qiáng)[19]。

式中：n為校正集樣品總數(shù)；m為驗(yàn)證集樣品總數(shù)；yi為第i個(gè)樣品的實(shí)測(cè)值為第i個(gè)樣品的預(yù)測(cè)值為第i個(gè)樣品的實(shí)測(cè)值的平均值。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

獲得最佳模型后，得出模型預(yù)測(cè)值，利用EXCEL對(duì)模型預(yù)測(cè)值和經(jīng)典滴定法實(shí)測(cè)值進(jìn)行雙樣本方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品光譜圖

圖1 紫林食醋樣品原始近紅外圖譜Fig.1 Original near infrared spectra of Zilin vinegar samples

圖1所示為QuasIR3000傅里葉變換近紅外光譜儀直接導(dǎo)出的106種食醋樣品原始近紅外圖譜，圖譜重疊度大，表明所抽取的樣品理化成分均一，且在波數(shù)為10 000～4 000 cm-1光譜掃描范圍內(nèi)樣品具有較強(qiáng)的噪音，譜圖平滑，均在近紅外譜區(qū)的合頻區(qū)域和倍頻區(qū)域[20]，即波數(shù)為5 500～4 000 cm-1和7 500～6 000 cm-1都有明顯的特征吸收峰，對(duì)近紅外圖譜進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)處理之后，光譜圖的吸收峰較為整齊、圓滑，表明試驗(yàn)中對(duì)食醋樣品所采用的光譜采集方式可行且有效。

2.2 近紅外模型建立

本試驗(yàn)定量預(yù)測(cè)建模數(shù)據(jù)分別采用適量歸一化、多元散射校正（multiple scatter correction，MSC）、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)、平滑數(shù)等方法相互結(jié)合，得到最優(yōu)光譜區(qū)間，利用偏最小二乘法（PLS）建立食醋總酸含量的校正數(shù)學(xué)模型。從已掃描的106個(gè)圖譜及對(duì)應(yīng)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)中，隨機(jī)抽取其中91個(gè)作為建模數(shù)據(jù)庫(kù)，并在建模過(guò)程中，每次從校正集中取出1個(gè)或多個(gè)樣品作為臨時(shí)驗(yàn)證樣品，以其余的樣品進(jìn)行建模，然后對(duì)這1個(gè)或多個(gè)樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，如此循壞，得到每個(gè)樣品的模型交叉預(yù)測(cè)值，最后，以交叉預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值誤差平方和的均方根值（RMSECV）、預(yù)測(cè)集均方根誤差（RMSEP）和決定系數(shù)R23個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)模型的精確度。本試驗(yàn)挑選了10個(gè)結(jié)果理想的預(yù)處理方法進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同預(yù)處理方法下食醋總酸含量的偏最小二乘法建模Table 1 Partial least squares model of total acid content of vinegar under different pretreatment

由表1可知，第1種組合預(yù)處理方法的最優(yōu)譜區(qū)范圍是4 594.42～5 195.35 cm-1、5 796.28～6 998.14 cm-1、8 800.94～9 401.87 cm-1，交叉驗(yàn)證決定系數(shù)R2是0.971 1，交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）是0.062 1，在所有預(yù)處理方法中R2為最大，RMSECV為最小，模型主成分因子數(shù)為10，模型擬合充分，且最穩(wěn)健、預(yù)測(cè)可靠性最好。因此，選擇第1種預(yù)方法（適量歸一化＋一階導(dǎo)數(shù)的光譜預(yù)處理方法）的模型作為預(yù)測(cè)食醋總酸的模型。

圖2 校正集樣品中食醋總酸含量實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性Fig.2 Correlation between measured values and predicted values of total acid contents of vinegar in calibration set samples

依據(jù)第1種預(yù)處理方法，利用VModel近紅外建模軟件得到校正模型-偏最小二乘（PLS）模型。食醋總酸PLS法所建模型的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)性散點(diǎn)分布圖見(jiàn)圖2，食醋總酸校正模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.990 2。校正集樣品中食醋總酸交互驗(yàn)證偏差相關(guān)性圖見(jiàn)圖3，散點(diǎn)分布均勻，表明食醋總酸預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的相關(guān)性良好，該模型具有預(yù)測(cè)可行性。

圖3 校正集樣品中食醋總酸含量交互驗(yàn)證偏差相關(guān)性Fig.3 Correlation of cross-validation bias of total acid contents of vinegar in calibration set samples

2.3 模型外部驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，試驗(yàn)過(guò)程同時(shí)采用外部驗(yàn)證方式驗(yàn)證模型效果，即將未參與建模的15個(gè)預(yù)測(cè)樣組成的預(yù)測(cè)集代入模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，同時(shí)與經(jīng)典電位滴定法測(cè)得的實(shí)際值進(jìn)行比較，每次試驗(yàn)進(jìn)行3組平行測(cè)定，對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，模型預(yù)測(cè)集的總酸結(jié)果與經(jīng)典電位滴定法測(cè)得的實(shí)際值相比，最大相對(duì)誤差為1.383%。

表2 偏最小二乘法模型的食醋總酸含量預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較Table 2 Comparison between predicted values and measured values of total acid content of vinegar in partial least squares model

為了檢驗(yàn)所建模型得預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值是否有顯著性差異，運(yùn)用EXCEL軟件對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行雙樣本方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量F＜臨界值Fcrit，表示兩組數(shù)據(jù)（實(shí)測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值）在α=0.05的水平上無(wú)顯著性差異[21]，且兩組數(shù)據(jù)間相關(guān)性系數(shù)為0.995，說(shuō)明使用“矢量歸一化＋一階導(dǎo)數(shù)”光譜預(yù)處理方法得到的食醋近紅外總酸模型得出的預(yù)測(cè)值和滴定法實(shí)測(cè)值沒(méi)有顯著性差異，該模型可以對(duì)食醋總酸進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表3 雙樣本方差分析Table 3 Variance analysis of two-sample

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，食醋總酸實(shí)測(cè)值與對(duì)應(yīng)采集的近紅外漫反射光譜相關(guān)聯(lián)建立快速檢測(cè)模型后，近紅外食醋總酸模型的交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R2）為0.972 3，交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）為0.062 1。經(jīng)外部模型驗(yàn)證后，該模型食醋總酸預(yù)測(cè)值和國(guó)標(biāo)法實(shí)測(cè)值的平均絕對(duì)偏差為0.035，最大相對(duì)誤差為1.383%，兩者間相關(guān)性系數(shù)達(dá)0.995。該方法能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)工業(yè)生產(chǎn)上食醋總酸的定量檢測(cè)，為建立食醋生產(chǎn)在線、無(wú)損、快速檢測(cè)方法提供了理論依據(jù)，對(duì)于食醋生產(chǎn)過(guò)程中需要頻繁測(cè)定總酸來(lái)控制生產(chǎn)進(jìn)程的企業(yè)提供了一種更加方便、快捷和綠色的方法。