李海印 姜 濤 高堯華 宋衛(wèi)得 劉 冰

（日照海關(guān) 山東日照 276826）

1 前言

隨著農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展及其應(yīng)用的加強(qiáng)，人們對營養(yǎng)和健康的認(rèn)識也隨之提高，蠶蛹的營養(yǎng)價(jià)值也引起了人們的廣泛關(guān)注。近年來，科研工作者就蠶蛹的成分在食品行業(yè)、飼料制造、化工行業(yè)、醫(yī)藥等不同領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了深入的研究[1-8]。目前，蠶蛹蛋白粉的深加工、蠶蛹水解氨基酸、蠶蛹?xì)ぞ厶窃谑称饭I(yè)領(lǐng)域的研究成果得到應(yīng)用。此外，蠶蛹還可用作蛹蟲草培育的優(yōu)良寄主[9-14]。隨著蠶蛹食用價(jià)值的不斷開發(fā)，對蠶蛹食品質(zhì)量控制變得愈加重要。長期以來，為使農(nóng)作物高產(chǎn)增收，農(nóng)產(chǎn)品在種植過程中使用了大量的農(nóng)藥，有些農(nóng)藥難以降解，污染二次種植及相關(guān)食物鏈產(chǎn)物，因此蠶蛹及其制品作為食品，在其流入市場之前有必要對其農(nóng)藥殘留含量進(jìn)行安全檢測。關(guān)于蠶蛹及其制品中農(nóng)藥殘留含量的檢測方法，目前國內(nèi)關(guān)注者甚少。

本研究基于蠶蛹中油脂含量高，基質(zhì)相對復(fù)雜等特點(diǎn)建立了一種蠶蛹中農(nóng)藥殘留含量的檢測方法。該方法可有效去除共提取干擾物，提高檢測準(zhǔn)確度，同時(shí)操作簡單，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可廣泛應(yīng)用于蠶蛹及其制品中多種農(nóng)藥殘留含量的檢測。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

氣相色譜/串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（Agilent 7890-7000BGC-MS/MS）；均質(zhì)器；KS260 振蕩器（德國 IKA）；Turbo Vap型氮?dú)獯蹈蓛x（美國Zymark公司）；T40離心機(jī)（上海安亭）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；PSA/C18 SPE 固相萃取柱（1 000 mg，6 mL，艾潔爾）。

乙腈、丙酮、正己烷、乙酸乙酯均為色譜純；35種農(nóng)藥化合物為農(nóng)業(yè)部有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（質(zhì)量濃度均為100 μg/mL）；溶劑：丙酮+正己烷（體積比為 5∶5）；無水氯化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 溶液配制

分別準(zhǔn)確量取各標(biāo)準(zhǔn)品（中國農(nóng)業(yè)部，純度≥99%），用正己烷配制成10 mg/L的單品種標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用時(shí)根據(jù)需要用正己烷稀釋配成不同濃度的工作液。

4%氫氧化鈉溶液：4 g氫氧化鈉溶解于水中，定容于100 mL容量瓶中。

0.5 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（磷酸二氫鉀∶磷酸氫二鉀=1∶1）：34.02 g磷酸二氫鉀和 57.06 g磷酸氫二鉀溶于水中，用4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7，定容于500 mL容量瓶中。

2.2.2 樣品前處理

稱取10.00g蠶蛹試樣（精確至0.02g），置于50mL離心管中，加入20 mL乙腈均質(zhì)提取2 min，加入5 g氯化鈉，10 mL磷酸鹽緩沖溶液，振蕩20 min，冷凍30 min后以5 000 r/min離心5 min，取上清液10 mL，氮?dú)獯抵两?，加? mL 1∶1丙酮+正己烷溶液，待凈化。

將濃縮液加入1∶1丙酮+正己烷淋洗過的PSA/C18固相萃取柱中，用2 mL 1∶1丙酮+正己烷溶液沖洗樣品管2次，2次清洗液均過固相萃取柱，用10 mL 1∶1丙酮+正己烷溶液洗脫，收集洗脫液置于氮吹管中，氮?dú)獯抵两桑蒙倭?∶1丙酮+正己烷溶液多次溶解殘?jiān)诳潭炔ＡЧ苤?，定容?.0mL，上機(jī)分析。

2.2.3 氣相色譜/串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀（GC-MS/MS）條件

色譜柱：HP-5MSUI（30 m×0.25 mm，0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣：高純氦氣（99.999%）；碰撞氣：高純氮（99.999%）；流速：1.1 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1.0 μL；柱溫：初始 70℃（2 min），以25℃/min程序升溫至150℃，再以3℃/min程序升溫至200℃，8℃/min程序升溫至280℃；輔助加熱溫度：280℃；溶劑延遲5 min；進(jìn)樣口溫度：280℃。離子源：EI源；離子源溫度：260℃；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥類化合物可溶于正己烷、乙酸乙酯、乙腈、加入磷酸鹽緩沖溶液的乙腈、加入醋酸緩沖溶液的乙腈等多種有機(jī)試劑，農(nóng)藥殘留提取方式有超聲波提取、均質(zhì)提取及振蕩提取等多種提取方法。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，蠶蛹類樣品通過先均質(zhì)提取后再進(jìn)行振蕩提取回收率明顯提高。在農(nóng)藥殘留提取過程中，選擇正己烷和乙酸乙酯作為農(nóng)藥殘留提取溶劑，在濃縮過程采用氮?dú)獯蹈珊笥椭y以有效去除，不易凈化，且回收率不理想。加入醋酸緩沖溶液的乙腈作為提取溶劑，在實(shí)驗(yàn)過程中部分農(nóng)藥殘留易降解，回收率低。以回收率最低組分為例，其對比結(jié)果詳見表1。

表1 多種提取溶劑對檢測回收率的影響

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也對磷酸鹽緩沖溶液的濃度進(jìn)行了對比，其對比結(jié)果詳見表2。

正己烷、乙酸乙酯、乙腈可以溶解大部分農(nóng)藥類化合物，但在提取過程中，蠶蛹油脂及蛋白質(zhì)含量高、成分復(fù)雜，普通溶劑提取的回收率低，油脂含量高，而加入磷酸鹽緩沖溶液的乙腈作為提取液回收率可以提高18.4%～39.2%，因此，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)最終確定加入0.5 mol/L磷酸緩沖溶液的乙腈為提取溶液， 采取均質(zhì)加振蕩的提取方式。樣品提取完畢后，實(shí)驗(yàn)對比冷凍與不冷凍條件下油脂去除效果，發(fā)現(xiàn)冷凍后取上層溶液，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊鬅o明顯油脂，進(jìn)樣后共提取物干擾峰降低，實(shí)驗(yàn)最終確定提取后增加冷凍步驟。

表2 多濃度緩沖溶液對檢測回收率的影響

3.2 凈化方式的選擇

蠶蛹類產(chǎn)品為高油脂、高蛋白樣品，在色譜檢測過程中共提取物油脂峰干擾目標(biāo)分析物檢測，不但影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，且損害色譜柱。本文對幾種常用的農(nóng)藥殘留凈化方式進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。對比結(jié)果詳見圖1。

現(xiàn)如今，常用的樣品前處理的凈化方式主要有QuEchERS方法以及最新報(bào)道的增強(qiáng)型脂質(zhì)去除（EMR）提取凈化法，本文將各種方法凈化效果進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，采取本文所述方法凈化效果最佳。同時(shí)對固相萃取柱的凈化效果進(jìn)行對比，選擇弗羅里硅土柱、固相萃取柱、氨基柱與PSA/C18柱對比實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)PSA/C18柱凈化后共提取物減少，可以有效去除干擾，靈敏度和準(zhǔn)確性均提高。研究表明蠶蛹樣品不同于植物源性油脂樣品，在QuEchERS方法中，C18和PSA的固體顆粒難以有效吸附油脂，凈化效果不理想。蠶蛹中油脂與肉、魚等樣品對比，其油脂含量低，油脂分子結(jié)構(gòu)也有所不同，因而在油脂去除過程中過單PSA/C18固相萃取柱即可有效凈化。

圖1 不同凈化方式凈化后對比色譜圖

3.3 濃縮方式的選擇

對旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮?dú)獯蹈?種不同濃縮方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用將標(biāo)準(zhǔn)溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮?dú)獯蹈?種條件下濃縮上機(jī)檢測，結(jié)果表明，乙酰甲胺磷、溴氰菊酯通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，其回收率較氮?dú)獯蹈蓾饪s方式降低11.5%～26.0%，實(shí)驗(yàn)選擇氮?dú)獯蹈傻臐饪s方法，將凈化溶液吹至無明顯液滴流動即可。

3.4 GC-MS/MS條件的選擇

35種農(nóng)藥類化合物沸點(diǎn)及分離溫度各不相同，在檢測過程中采用程序升溫，提高各物質(zhì)的分離度，有效改善峰形。將單一標(biāo)準(zhǔn)品全掃描（SCAN）模式掃描，通過色譜峰的出峰時(shí)間確定每種化合物的保留時(shí)間（圖 2）。

圖2 溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10 μg/mL)在MRM模式下的總離子流圖

從每種化合物的一級質(zhì)譜圖中選擇母離子碎片，通過選擇不同碰撞能量對母離子進(jìn)行碰撞解離，進(jìn)而選擇子離子，并確定離子對的最佳碰撞能量，建立多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下定性、定量分析方法。該方法可有效提高各類化合物的靈敏度和分離度，使35種化合物檢測低限均可達(dá)到0.01mg/kg。

3.5 方法線性關(guān)系與檢出限

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，樣品凈化后基質(zhì)對目標(biāo)物的準(zhǔn)確性無明顯影響。用丙酮-正己烷（體積比1∶1），配制35種農(nóng)藥基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為0.050 mg/L，0.10 mg/L，0.20 mg/L，0.50 mg/L，1.0 mg/L。 以每種農(nóng)藥化合物定量離子的峰面積y和相應(yīng)的質(zhì)量濃度x（mg/L）為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到該化合物線性方程與線性相關(guān)系數(shù)，35種化合物其線性系數(shù)均大于0.99，表明35種農(nóng)藥類化合物在該方法檢測中具有良好的線性關(guān)系。通過檢測空白樣品的3倍信噪比確定該方法的檢出限，檢測空白樣品的10倍信噪比確定該方法的定量限，蠶蛹中35種農(nóng)藥化合物的檢出限為0.001～0.005 mg/kg，可滿足我國對蠶蛹中農(nóng)藥殘留的監(jiān)控要求。

3.6 方法的回收率與精密度

選取空白蠶蛹產(chǎn)品，分別添加10μg/kg，20μg/kg，100 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，按上述前處理方法對回收率和精密度進(jìn)行測試，3個(gè)不同濃度水平每個(gè)重復(fù)測定6次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果詳見表3。

表3 蠶蛹樣品中35種農(nóng)藥殘留回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

續(xù)表3

由表3可知，35種待測化合物的添加回收率為76.7%～105.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36%～9.7%。該方法的準(zhǔn)確度及精密度大于EMR方法所述回收率為50%，也高于普通QuEchERS方法回收率，凈化效果更理想。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定，QuEchERS和EMR前處理方式在提取和凈化過程中大量放熱，部分農(nóng)藥類化合物遇熱易分解，這使得該類化合物在前處理過程中被吸附和降解從而導(dǎo)致回收率低。本方法凈化效果好，靈敏度高，精密度和準(zhǔn)確度均滿足方法學(xué)指標(biāo)，適用于蠶蛹中的農(nóng)殘檢測。

按上述實(shí)驗(yàn)方法對10批次蠶蛹樣品中35種農(nóng)藥類化合物進(jìn)行測定分析，考察各化學(xué)成分的準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明，各化學(xué)成分精密度和準(zhǔn)確度均可滿足國標(biāo)方法學(xué)中該類農(nóng)藥殘留檢測的要求，較其他方法回收率和精密度均有提高。

4 結(jié)論

本研究建立了蠶蛹中35種農(nóng)藥殘留含量的氣相色譜/串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜檢測方法。本方法選用乙腈加磷酸緩沖溶液作為提取，PSA/C18復(fù)合固相萃取柱凈化，配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，該方法可以對蠶蛹中35種農(nóng)藥殘留含量進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析，具有回收率和精密度良好，前處理操作簡單快速、成本低等優(yōu)點(diǎn)，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足蠶蛹類產(chǎn)品農(nóng)藥殘留含量檢測分析的技術(shù)需求。