張悅　王靜怡

摘 要：食品微生物檢驗(yàn)是保障食品安全的重要途徑，但傳統(tǒng)的食品微生物檢測技術(shù)成本高、耗時長，檢測結(jié)果的精準(zhǔn)性也有待提升，如何準(zhǔn)確、快速地檢測食品微生物已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。鑒于此，本文將探究分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，旨在為一線工作提供理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)技術(shù);食品;微生物檢驗(yàn);核酸探針技術(shù)

Abstract：Food microbe detection is an important way to ensure food safety， but traditional food microbe detection technology has a high cost and time-consuming， and the accuracy of detection results needs to be improved. How to detect food microbe accurately and quickly has become the current research hotspot. In view of this， this paper will explore the application of molecular biology technology in food microbiological test， in order to provide theoretical guidance for the first-line work.

Key words：Molecular biology technology; Food; Microbiological test; Nucleic acid probe technology

中圖分類號：TS207.4

食品安全直接關(guān)系到人類的身體健康以及社會的穩(wěn)定發(fā)展，保障食品安全刻不容緩。近年來，全球食品安全問題屢見不鮮，及時檢測食品致病菌成為保障食品安全的重點(diǎn)環(huán)節(jié)。本文以分子生物學(xué)技術(shù)為研究對象展開論述。

1 核酸探針技術(shù)

二十世紀(jì)七十年代，在基因工程學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展出了一種新型分子生物學(xué)技術(shù)—核酸探針技術(shù)。該技術(shù)利用DNA、RNA探針可與微生物核酸相結(jié)合的原理，實(shí)現(xiàn)對微生物的有效檢測。核酸探針技術(shù)無放射性，敏感且特異，無需進(jìn)行復(fù)雜的細(xì)菌培養(yǎng)，在大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸菌等食品微生物的檢驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用[1]?，F(xiàn)階段，可直接利用核酸探針技術(shù)檢測蔬菜沙拉中的微生物類型。

2 基因芯片技術(shù)

隨著醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)得到了長足發(fā)展?；蛐酒夹g(shù)是利用細(xì)菌的共有基因這一靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用芯片探針檢測共有基因上不同細(xì)菌的獨(dú)特堿基，進(jìn)而針對性區(qū)分細(xì)菌種類?；蛐酒啥喾N核酸探針組成，可通過調(diào)整或增加探針等方式，提高芯片的準(zhǔn)確性，擴(kuò)大基因芯片的檢測范圍。有研究學(xué)者通過基因芯片技術(shù)，成功地鑒定出了多種李斯特菌分離物[2]。

3 DNA指紋圖譜技術(shù)

3.1 電泳主導(dǎo)技術(shù)

以電泳為主導(dǎo)的DNA指紋圖譜技術(shù)可分為變性梯度凝膠電泳技術(shù)以及溫度梯度凝膠電泳技術(shù)。前者是通過檢測不同序列DNA的濃度來進(jìn)行檢測，因解鏈行為各有不同，會在凝膠的不同位置留下不同序列的DNA片段，經(jīng)染色后便呈分散的條帶分布，西方研究人員成功利用這一技術(shù)對南非益生菌食品以及自制山羊干酪中的乳酸菌進(jìn)行了鑒定。后者是在前者的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種指紋圖譜技術(shù)，與前者不同的是其在凝膠中采用的是溫度梯度而非濃度梯度，這一技術(shù)能快速檢測出菌群構(gòu)成[3]，西方研究人員成功使用該技術(shù)檢測了人類糞便的微生物區(qū)系，但目前該技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用還比較少[4]。

3.2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)

該技術(shù)是利用隨機(jī)引物，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增靶細(xì)胞DNA，并進(jìn)一步分析出DNA片段的數(shù)量以及片段大小，再利用DNA差異進(jìn)行分子標(biāo)記。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA技術(shù)以微生物的基因組為對象進(jìn)行分析，具有較高的特異性和靈敏度，尤其適合檢測DNA序列不明確以及分子生物特征不明顯的乳酸菌和真菌，西方研究人員就通過這一技術(shù)鑒定出了紅葡萄酒中的植物乳桿菌菌株[5]。

3.3 擴(kuò)增片段多肽分析技術(shù)

該技術(shù)能對DNA片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，并通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳或瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，然后結(jié)合帶型特征來分析擴(kuò)增片段的多態(tài)性。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)是一種通用技術(shù)，可用于分析任意來源的DNA圖譜，目前主要用來分析多種來源DNA圖譜、鑒定未知菌株、研究遺傳多樣性等。有研究人員通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)分析了發(fā)酵面團(tuán)中的乳酸菌，并鑒定了傷寒沙門菌的分型[6]。與脈沖場凝膠電泳以及基因探針技術(shù)相比，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)的分析能力更強(qiáng)。

4 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

2000年，西方研究人員開發(fā)出了一種新型環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，這是一種不同于傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)基于靶基因的6個區(qū)域，合理設(shè)計(jì)4種特異引物，然后加入相應(yīng)的物質(zhì)，在65 ℃中保持15～60 min，就可以完成109～1010倍的擴(kuò)增。該過程主要分為3個階段：①原料底物儲備階段，在這一階段需要引入內(nèi)引物BIP以及外引物F3，其間會形成一條稱之為“啞鈴結(jié)構(gòu)”的環(huán)狀單鏈。②循環(huán)擴(kuò)增階段，在這一階段，啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA會在自我引導(dǎo)模式下進(jìn)行延伸，進(jìn)而形成雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。③伸長與再循環(huán)階段，在這一階段DNA會進(jìn)一步擴(kuò)增，進(jìn)而形成更加復(fù)雜的DNA混合物。從整體上來說，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有靈敏度高、特異性高的優(yōu)勢，且操作比較簡單，檢測人員只需要觀察反應(yīng)的渾濁度就能判斷是否出現(xiàn)擴(kuò)增。與傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)相比，環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無需昂貴的試劑與儀器，其應(yīng)用前景十分廣闊[7]。

5 展望

現(xiàn)階段，食品安全問題已成為全球人類共同關(guān)注的熱點(diǎn)問題，越來越多的人們開始關(guān)注食源性疾病的預(yù)防，積極建立更加簡便、可靠、有效的微生物檢測技術(shù)，已成為食品微生物檢測的發(fā)展趨勢，同時也是保證食品安全的重要途徑。分子生物學(xué)技術(shù)因靈敏、準(zhǔn)確和快速等優(yōu)勢，已在環(huán)境微生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，今后，分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用，勢必會為我國食品安全事業(yè)的順利推進(jìn)提供有力的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

[1]王肖肖.淺談PCR聯(lián)合核酸探針技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用[J].科技展望，2017（20）：92.

[2]Yang Pengxin，Zhang Ziqun，Lu Yi-xin，et al. Development of liquid gene chip technique for detecting Toxoplasma gondii and Trichinella spiralis in food[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，2010，13（11）：814-817.

[3]R Heide，E Heir，A. Holck. Detection of eight GMO maize events by qualitative， multiplex PCR and fluorescence capillary gel electrophoresis[J]. European Food Research & Technology， 2015，227（2）：527-535.

[4]Tom Vanhoutte，Geert Huys，Evie De Brandt，et al. Temporal stability analysis of the microbiota in human feces by denaturing gradient gel electrophoresis using universal and group-specific 16S rRNA gene primers[J]. Fems Microbiology Ecology，2015，48（3）：437-446.

[5] Landry B S，Dextraze L，Boivin G. Random amplified polymorphic DNA markers for DNA fingerprinting and genetic variability assessment of minute parasitic wasp species （Hymenoptera： Mymaridae and Trichogrammatidae） used in biological control programs of phytophagous insects[J]. 2014，36（195）：69–83.

[6]Fry N K，Savelkoul P H M，Visca P. Amplified fragment-length polymorphism analysis[J].Methods in Molecular Biology，2016，551（551）：89.

[7]趙彩紅，高 強(qiáng)，李明生，等.環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2017（22）：28-30.