黃舒穎，張誠，黃自坤，羅清，卿城

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，1.婦產(chǎn)科，2.超聲科，3.檢驗(yàn)科，4.重癥醫(yī)學(xué)科，南昌330006；5.江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院助產(chǎn)系，南昌330052）

膿毒癥（sepsis）是由感染因素造成的宿主免疫反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而造成器官功能損害。 在膿毒癥發(fā)展致使器官損害過程中， 肺部是最容易受到攻擊并出現(xiàn)損傷的部位， 嚴(yán)重時(shí)常導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征 （Acute respiratory distress syndrome，ARDS）[1,2]。 盡管臨床上采取抗生素使用、抗炎、保護(hù)性通氣策略, 甚至體外膜肺氧合（ECMO，extracorporeal membrane oxygenation） 等綜合措施來處理嚴(yán)重的ARDS，但不得不承認(rèn)，該疾病的救治成功率仍然有限， 是當(dāng)前重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的一道棘手的重點(diǎn)、難點(diǎn)問題[3]。

肺泡巨噬細(xì)胞（alveolar macrophage，AM）是肺部常駐免疫細(xì)胞，直接與外界空氣相通，因此是呼吸系統(tǒng)抵抗致病微生物的第一道關(guān)卡[4,5]。疾病狀態(tài)下，細(xì)菌等致病因素持續(xù)刺激AM 可導(dǎo)致炎癥信號(hào)通路核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化，大量釋放IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎癥因子及各種趨化因子， 誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在肺部聚集，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步級(jí)聯(lián)放大，最終導(dǎo)致ARDS發(fā)生[6]。因此，AM 在ARDS 疾病發(fā)生及發(fā)展過程中扮演重要角色。

長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA,lncRNA) 是一類長度大于200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在免疫、腫瘤等疾病中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。 近年有研究顯示，lncRNA NEAT1 （以下簡稱NEAT1）與炎癥免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)。 膿毒癥時(shí)患者PBMC 細(xì)胞內(nèi)NEAT1 表達(dá)顯著上升， 是膿毒癥診斷的一個(gè)分子標(biāo)志物[7]；NEAT1 沉默可以改善脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠心肌損傷通過，其機(jī)制是通過抑制TLR2/NF-κB 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的[8]。 我們在結(jié)核菌感染的RAW264.7 巨噬細(xì)中發(fā)現(xiàn)NEAT1 表達(dá)上調(diào)， 沉默NEAT1 可減弱其對(duì)胞內(nèi)結(jié)核菌清除能力[9]。 但是在AM 中，NEAT1 的功能與作用尚未見報(bào)道。 因此，本研究以AM 為出發(fā)點(diǎn)，研究膿毒癥條件下NEAT1 表達(dá)改變，以及NEAT1 沉默后對(duì)AM 炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 NR8383 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；LPS 購自美國sigma公司；DMSO 購自美國Hyclone 公司；PBS 緩沖液購自上海金穗生物科技有限公司； 胎牛血清購自上海依科賽；TRIzol 試劑和LipofectmineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；PCR 引物由中國上海生工生物工程公司合成；Ham’s F-12K 培養(yǎng)基、IL-6 ELISA 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司； 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR 試劑盒購自大連寶生物TaKaRa 公司；siRNA 干擾試劑購自廣州銳博公司。 兔抗NF-κB p65（ab16502）購買于美國Abcam 公司，山羊抗兔IgGg（ZB-5301）購買自中杉金橋。 Thermo Scientific NE-PER 購自賽默飛世爾中國； 熒光定量PCR 儀器采用美國ABI 公司Applied Biosystems 7600 系統(tǒng)。 其它所用試劑均為分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) NR8383 大鼠肺泡巨噬細(xì)胞種植在含有FBS 的15%的Ham’s F-12K 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3d 換液或傳代一次。

1.3 siNEAT1 肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染 制備NEAT1 siRNA 以及control siRNA （siNC）， 具體由上海Gene Pharma 公司完成。siRNA 引物序列[11]：正義序列：5'-GUGAGAAGUU GCUUAGAAACUUUCC-3'，反義序列：5' - GGAAAGUUUCUAAGCAACUU CUCACUU-3'。 肺泡巨噬細(xì)胞分為三組：空白對(duì)照組，siNC 轉(zhuǎn)染組以及siNEAT1 轉(zhuǎn)染組。 細(xì)胞貼壁90 分鐘后，根據(jù)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書對(duì)siNC 或siNEAT1 進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞放在孵箱中培養(yǎng)4-6 h 后更換完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后24h 收集細(xì)胞，TRIzol 試劑提取細(xì)胞總RNA，RT-qPCR 檢測siRNA 敲減效果。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組與處理 將對(duì)數(shù)生長時(shí)期的肺泡巨噬細(xì)胞加入24 孔板， 培養(yǎng)1 h， 隨機(jī)進(jìn)行分組：⑴對(duì)照組: 未經(jīng)LPS 處理，加入等體積PBS; ⑵LPS 組: 加入終濃度10 mg /L 的LPS 培養(yǎng)12h；⑶siNC + LPS（10 mg /L）組；⑷siNEAT1 + LPS（10 mg/L） 組，12h 后分別收集各組分細(xì)胞和培養(yǎng)上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 IL-6 蛋白測定 ELISA 試劑盒檢測培養(yǎng)上清液IL-6 濃度，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考試劑盒說明書。

1.6 IL-6 mRNA 和lncRNA NEAT1 測定 RTqPCR 檢測各組細(xì)胞內(nèi)IL-6 mRNA 和lncRNA NEAT1 表達(dá)，Trizol 法提取細(xì)胞總RNA, 按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將細(xì)胞中RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA;PCR 引物購買于上海生工生物公司。 以GAPDH 為內(nèi)參基因,各基因引物序列如下:GAPDH上游引物:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游 引 物 :5' -TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3'。NEAT1 上游引物:5'-CTTCCTCCCTITAACTTATCC ATTCAC-3' ,下游引物:5' -CTCTTCCTCCACCATT ACCAACAATAC-3'[10]。 IL-6 上游引物: 5′-AAAC TAGTGAAATATATCCTGTTGTCAGG-3′，下游引物序列：5′-GGAAGCTTCCAACATTCATATTGTCAGT TC-3′[11]。qPCR 反應(yīng)采用SYBR Premix EX TaqTM II，使用ABI 7500 系統(tǒng)進(jìn)行上機(jī)，具體的檢測步驟及反應(yīng)條件設(shè)置都按照試劑盒說明書進(jìn)行。 所有樣品做3 復(fù)孔，RNA 相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct方法計(jì)算所得。

1.7 肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB 核移檢測 根據(jù)Thermo Scientific NE-PER 核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒使用說明操作，提取細(xì)胞核蛋白。Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 表達(dá)， 選取Lamin B 作為胞核內(nèi)參； 主要實(shí)驗(yàn)步驟常規(guī)SDS-PAGE 凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫學(xué)處理和曝光。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以(x±s)表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS 刺激NR8383 肺泡巨噬細(xì)胞后NEAT1 和IL-6 mRNA 表達(dá)變化RT- qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，胞內(nèi)IL-6 mRNA（t=9.36，P＜0.01）和NEAT1 均表達(dá)上調(diào)（t=8.79，P＜0.01）（圖1）。

圖1 LPS 刺激肺泡巨噬細(xì)胞后NEAT1、IL-6 表達(dá)mRNA；*與對(duì)照組比

2.2 NEATl 沉默對(duì)NR8383 肺泡巨噬細(xì)胞IL-6 分泌的變化 圖2A 結(jié)果表明，RNAi 轉(zhuǎn)染成功地沉默了肺泡巨噬細(xì)胞NEAT1 表達(dá)(t=5.22, P<0.05)。 各組細(xì)胞分別用LPS 刺激，圖2B 結(jié)果表明，正常細(xì)胞分泌少量IL-6，LPS 可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量IL-6 (t=8.37,P<0.05)，RNAi 轉(zhuǎn)染沉默NEAT1 后細(xì)胞IL-6 分泌量較轉(zhuǎn)染對(duì)照序列細(xì)胞(siNC) 顯著減少(t=4.61,P<0.05)。

圖2 ELISA 檢測NEAT1 沉默后LPS 刺激時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞IL-6分泌量變化 與NC 組比較：*P＜0.01；與siNC 組比較#P＜0.05

2.3 NEAT1 沉默對(duì)LPS 誘導(dǎo)NR8383 肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB 核移位的影響 NEAT1 沉默可抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB 核移位，表現(xiàn)為NF-κB p65 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)較LPS 組下調(diào)，見圖3、表1。

3 討論

圖3 NEAT1 沉默對(duì)細(xì)胞NF-κB p65 蛋白核移位影響

表1 NEAT1 沉默對(duì)細(xì)胞NF-κB p65 蛋白核移位影響

嚴(yán)重膿毒癥病人出現(xiàn)ARDS 時(shí)， 由于肺部強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，肺泡-毛細(xì)血管通透性增加，造成滲透性肺水腫、透明膜形成、肺不張表現(xiàn)，使患者出現(xiàn)難治性嚴(yán)重呼吸困難。 肺泡巨噬細(xì)胞在該病的發(fā)生過程中，發(fā)揮重要的作用。 表現(xiàn)為在接受到感染因素刺激時(shí)，迅速分泌炎癥因子，以對(duì)抗致病微生物入侵。 經(jīng)典的炎癥反應(yīng)過程中，如革蘭陰性菌LPS 通過與肺泡巨噬細(xì)胞膜表面的TLR4(Tolllike Receptor，TLR4） 結(jié)合， 啟動(dòng)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，活化NF-κB 炎性通路，啟動(dòng)IL-6、IL-1β 等炎癥因子的合成、分泌過程[12]。 本研究證實(shí)，LPS 刺激情況下，NR8383 肺泡巨噬細(xì)胞炎癥因子IL-6 合成顯著上升。 即LPS 刺激肺泡巨噬細(xì)胞后有效啟動(dòng)了炎癥免疫反應(yīng)過程。

在炎癥反應(yīng)過程中， 存在許多參與炎癥進(jìn)程的分子。 lncRNA 是近年研究火熱的一類炎癥調(diào)控分子。如lncRNA NKILA 是內(nèi)皮細(xì)胞炎癥的關(guān)鍵抑制因子，與頸動(dòng)脈粥樣硬化有顯著相關(guān)性[13]。 LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞表達(dá)lncRNA HOTAIR， 而敲除HOTAIR 可抑制NF-κB 信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[14]。 lncRNA NEAT1 同樣在炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用， 如吳緬教授課題組發(fā)現(xiàn)受低氧誘導(dǎo)因子HIF-2α 轉(zhuǎn)錄激活的NEAT1 可以直接參與炎癥小體的組裝和激活， 控制巨噬細(xì)胞促炎因子IL-1β和IL-18 的成熟和分泌， 是一個(gè)重要的促炎分子[15]。 在膿毒癥腎損傷疾病模型中，NEAT1 可通過抑制NF-κB 活化， 下調(diào)腎系膜細(xì)胞IL-6、IL-1β 分泌，減少氧化應(yīng)激分子一氧化氮產(chǎn)生[16]。 在肺泡巨噬細(xì)胞中，NEAT1 的功能知之甚少，我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，受LPS 刺激的NR8383 肺泡巨噬細(xì)胞一方面會(huì)上調(diào)表達(dá)NEAT1，另一方面在下調(diào)NEAT1 的細(xì)胞中IL-6 分泌減少， 表明NEAT1 可抑制LPS 所致肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。

哺乳動(dòng)物中，NF-κB 是由p65/RelA、p50、p52、Rel-B、c-Rel 五種亞基以二聚體的方式組合構(gòu)成的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族， 其中p65 與和p50 組成的異二聚體是NF-κB 最常見的二聚體。 在靜息狀態(tài)下抑制因子（IκB）與NF-κB 結(jié)合，以無活性狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中。 當(dāng)炎癥過程啟動(dòng)后，IκB 被磷酸化降解，釋放出NF-κB。 游離活化的NF-κB 迅速入核，與DNA 特定位點(diǎn)結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生細(xì)胞因子[17,18]。 本研究中，LPS 刺激NR8383 肺泡巨噬細(xì)胞可有效誘導(dǎo)NF-κB 信號(hào)通路活化， 表現(xiàn)為NF-κB p65 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)增多； 而通過siRNA 下調(diào)NEAT1， 可有效抑制NF-κB p65 蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)。

綜上，NEAT1 可抑制LPS 誘導(dǎo)的NR8383 肺泡巨噬細(xì)胞促炎反應(yīng)過程，其機(jī)制可能與減少IL-6 分泌、抑制NF-κB 信號(hào)通路活化有關(guān)。