邵強(qiáng)，劉芬，李勇，徐澤堯，陶文強(qiáng)，張建國(guó)，趙寧，錢克儉

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南昌330006；2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌330006）

鐵死亡(Ferroptosis) 是一種鐵依賴性的，以脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累為特征的非細(xì)胞凋亡形式的細(xì)胞死亡。 脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累是細(xì)胞死亡的主要原因，它的形成與活性氧(ROS)有關(guān)。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4 (Glutathione peroxidase 4, GPX4) 是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。 目前已知鐵死亡參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，如腫瘤，神經(jīng)系統(tǒng)疾病、組織缺血再灌注損傷、炎癥反應(yīng)、腎衰竭等。 在炎癥反應(yīng)中，上皮細(xì)胞等發(fā)生鐵死亡釋放炎癥因子或免疫細(xì)胞直接發(fā)生鐵死亡參與炎癥反應(yīng)調(diào)控。 研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌通過(guò)脂氧合酶誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，是其致病的重要機(jī)制[1]。 LPS 是TLR4/NF-κB 炎癥通路激活劑， 常常用于構(gòu)建炎癥反應(yīng)模型[2,3]。在LPS 誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中，鐵死亡是否參與其調(diào)控，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究將鐵死亡激活劑應(yīng)用于LPS 誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型，檢測(cè)支氣管上皮細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討鐵死亡在支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 HBE 細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)、胎牛血清（GIBCO 公司，美國(guó)）、DMEM 高糖培養(yǎng)液（BI 公司 以色列）、LPS（E.coli，O111:B4，Sigma 公司,美國(guó)）、Erastin（Sigama-Aldrich,E7781）、Ferrostain -1 （Sigama -Aldrich，SML0583）、TRIzol（Invitrogen，美國(guó)）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索萊 寶 科 技 有 限 公 司）、PrimeScript·RT reagent Kit(DRR037S， 大 連 寶 生 物 工 程 有 限 公 司)、SYBR Premix Ex Taqtm II (DRR820S，大連寶生物工程有限公司)、β-actin 及IL-6 引物由北京擎科公司合成、ABI Step One Plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、超速離心機(jī)（Thermo Fisher 公司，美國(guó)）、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBE 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清,不含丙酮酸鈉的DMEM 高糖培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2-3d 更換培養(yǎng)液。

1.2.2 MTT 比色法檢測(cè)Erastin 對(duì)細(xì)胞活性的影響取指數(shù)生長(zhǎng)期HBE 細(xì)胞，按每孔5×103接種至96孔板，細(xì)胞貼壁90min 后，分別加入10μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L 終濃度的Erastin，每組設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（等體積PBS 替代Erastin） 及 陽(yáng) 性 對(duì) 照 組 （10%DMSO 替 代Erastin），加藥后細(xì)胞培養(yǎng)24h，再加入5 g/L MTT溶液10μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液后每孔加入200μl DMSO，用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570nm）測(cè)定各孔的吸光度（OD 570nm）值。

1.2.3 處理及分組 取指數(shù)生長(zhǎng)期HBE 細(xì)胞，按每孔細(xì)胞5×105接種至6 孔板，每孔2ml。實(shí)驗(yàn)分為5組：⑴PBS 對(duì)照組：加入等體積PBS 溶液；⑵LPS組：加入0.1g/L LPS 溶液；⑶ERA 組：加入20μmol/L Erastin 溶液； ⑷LPS+ERA 組： 加入20μmol/L Erastin 溶液預(yù)處理30min 后， 加入0.1g/L LPS 溶液；⑸LPS+FER-1 組：加入500nmol/L Ferrostain-1溶液預(yù)處理30min 后，加入0.1g/L LPS 溶液。 細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，收集細(xì)胞，用于提取總RNA。

1.2.4 q-PCR 檢測(cè) 采用TRIzol 法提取細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性及純度， 紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA 濃度， 采用takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 應(yīng)用SYBR Green 熒光染料試劑盒進(jìn)行q-PCR，所有操作均在冰上完成，選取β-actin RNA 作為內(nèi)參照，目的基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt 表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 應(yīng)用GraphPad Prism 5 軟件作圖。數(shù)據(jù)以均差±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT 比色法檢測(cè)Erastin 對(duì)HBE 細(xì)胞活性的影 響 Erastin 在10 ～80μmol/L 的 濃 度 范 圍 內(nèi) 對(duì)HBE 細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用，見(jiàn)圖1。

圖1 MTT 比色法檢測(cè)Erastin 對(duì)HBE細(xì)胞活性的影響

2.2 Erastin 對(duì)細(xì)胞IL-6 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響與PBS 對(duì)照組相比，LPS 組、ERA 組和LPS+ERA組IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著增高(P＜0.01)。 與LPS 組相比，LPS+ERA 組IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量顯著增高(P＜0.01)，LPS+FER-1 處理組IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見(jiàn)圖2。

圖2 HBE 細(xì)胞中的IL-6 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

3 討論

鐵死亡由Stockwell 等學(xué)者于2012 年提出，其在形態(tài)學(xué)、 生物化學(xué)以及基因?qū)W方面均不同于凋亡、壞死和自噬等死亡形式。 多不飽和脂肪酸在脂氧合酶( LOXs) 的作用下發(fā)生氧化，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物， 而脂質(zhì)過(guò)氧化物的積累是細(xì)胞鐵死亡的主要機(jī)制。 脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生依賴于細(xì)胞內(nèi)鐵的芬頓反應(yīng)， 其清除主要由谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)完成，故可認(rèn)為鐵、脂質(zhì)過(guò)氧化物和GPX4 是鐵死亡的3 個(gè)重要關(guān)鍵因素，早期研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，鐵死亡能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4,5]。 隨著鐵死亡研究的廣泛開(kāi)展， 越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡普遍存在于人體細(xì)胞中， 并且與多種疾病狀態(tài)密切相關(guān)，其中包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、組織缺血再灌注損傷、炎癥反應(yīng)、腎衰竭等[6-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡時(shí)，通過(guò)釋放損傷相關(guān)分子模式 （damage -associated molecular patterns,DAMPs）家族成員高遷移率族蛋白1 (high mobility group box 1,HMGB1) 活化巨噬細(xì)胞， 激活炎癥反應(yīng)[11]。 構(gòu)建大鼠心力衰竭模型后，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞出現(xiàn)鐵死亡，而沉默TLR4 能抑制心肌細(xì)胞鐵死亡，改善大鼠心功能[14]。 此外，Hee 等人研究發(fā)現(xiàn)小劑量鐵死亡激活劑Erastin 對(duì)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞活性無(wú)影響， 并且能夠抑制NF-κB 信號(hào)通路，減輕LPS 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[13]。 本研究同樣發(fā)現(xiàn)，小劑量Erastin 對(duì)支氣管上皮細(xì)胞活性無(wú)明顯影響。這與Tang 等研究結(jié)果相似，他們采用Erastin 刺激人外周血單核細(xì)胞，并未引起細(xì)胞鐵死亡，反而促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖與分化[14]。 同時(shí)，我們檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)炎癥介質(zhì)IL-6 mRNA 表達(dá)變化， 結(jié)果顯示Erastin 能夠誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，并能夠放大LPS 誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的釋放。 我們研究結(jié)果與Tang 等研究結(jié)果相類似，他們誘導(dǎo)MEF細(xì)胞鐵死亡， 并與BMDM 細(xì)胞共培養(yǎng)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)MEF 鐵死亡后釋放炎癥介質(zhì)HMGB1， 并激活BMDM 釋放炎癥因子[11]。此外，F(xiàn)errostatin-1(Fer-1)可以抑制LOXs 的活性，是鐵死亡抑制劑，我們將Fer-1 預(yù)處理支氣管上皮細(xì)胞后加入Erastin，結(jié)果顯示Fer-1 能夠減輕炎癥介質(zhì)釋放。這表明Erastin未能誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞鐵死亡， 但能誘導(dǎo)并放大炎癥介質(zhì)釋放。

總之,支氣管上皮細(xì)胞是肺組織應(yīng)對(duì)感染的第一道屏障,支氣管上皮細(xì)胞的損傷以及炎癥介質(zhì)的釋放可能是啟動(dòng)肺內(nèi)炎癥瀑布反應(yīng)的關(guān)鍵。Erastin是鐵死亡誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)了支氣管上皮細(xì)胞釋放炎癥因子，但未能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，可能與不同細(xì)胞類型及細(xì)胞外環(huán)境相關(guān)。 我們推測(cè)Erastin 可能通過(guò)不同的通路,參與調(diào)控細(xì)胞的病理狀態(tài)。因此，下一步我們將采用高通量測(cè)序檢查差異表達(dá)基因與蛋白，篩選目標(biāo)基因或蛋白，進(jìn)一步研究Erastin誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)的機(jī)制。