戴宇婷 趙曉星 張金璽

作者單位：昭通市食品藥品檢驗所藥品微生物室，云南 昭通657000

微生物培養(yǎng)基是專供微生物生長繁殖使用的混合營養(yǎng)制品，一般都含有碳源、氮源、無機(jī)鹽以及生長因子和水等。作為科學(xué)研究和應(yīng)用科學(xué)的重要支撐條件，發(fā)揮著其他手段不可替代的作用[1]。培養(yǎng)基質(zhì)量是微生物學(xué)檢驗的基礎(chǔ)，其質(zhì)量優(yōu)劣可影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[2]，培養(yǎng)基的配制、保存尤為重要[3]。為保證微生物生長、分離及鑒定等過程可靠，試驗結(jié)果準(zhǔn)確，需保證所用培養(yǎng)基質(zhì)量可靠、制備方法適宜、滅菌過程和貯藏條件等通過質(zhì)量控制試驗。適宜的培養(yǎng)基制備方法、貯藏條件和質(zhì)量控制試驗是提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證[4-5]，本試驗通過對培養(yǎng)基配制、滅菌和貯藏進(jìn)行驗證，使整個過程受控，通過定期的穩(wěn)定性檢查確定了培養(yǎng)基的貯藏條件及貯藏期限，確保所配制的培養(yǎng)基可滿足藥品微生物檢查的要求。

1 材料與儀器

1.1 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基（北京三藥科技開發(fā)公司）：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基SDB，批號分別為：1612232、160913、150625、151215、160712、151102。中國食品藥品檢定研究院：R2A瓊脂對照培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對照培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂對照培養(yǎng)基，批號分別為：135027-201401、135013-201502、135005-201404、135025-201603。

1.2 菌種

中國食品藥品檢定研究院：黑曲霉 [CMCC（F）98 003]、白色念珠菌 [CMCC（F）98 001]、金黃色葡萄球菌 [CMCC（B）26 003 ]、銅綠假單胞菌 [CMCC（B）10 104]、枯草芽孢桿菌 [CMCC（B）63 501]，傳代次數(shù)均未超過5代。

1.3 儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱LRH-250F（上海一恒科技有限公司），恒溫水浴鍋HH-S24（金壇市大地自動化儀器廠），生物安全柜BHC-1300ⅡA2（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-75G（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌至TSB中，35℃培養(yǎng)24 h；接種白色念珠菌至SDB中，25℃培養(yǎng)3 d；接種黑曲霉至SDA上，25℃培養(yǎng)7 d，用5 mL無菌0.9%氯化鈉溶液將孢子洗脫轉(zhuǎn)移至無菌試管內(nèi)。取上述培養(yǎng)物，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌或孢子數(shù)≤100 CFU的菌或孢子懸液，備用。

1.4.2 培養(yǎng)基的制備 根據(jù)各培養(yǎng)基包裝上的使用說明進(jìn)行制備、分裝，置壓力蒸汽滅菌器中，121℃、0.14 MPa滅菌15 min。

1.4.3 培養(yǎng)基的貯藏 滅菌后的培養(yǎng)基2～8℃避光貯藏，貯藏效期30 d。滅菌后貯藏的凝固培養(yǎng)基，置于恒溫水浴鍋中沸水浴加熱（1次再融化），待培養(yǎng)基完全融化溫度降至不超過45℃使用。

1.5 監(jiān)控項目

1.5.1 pH值測定 測定各培養(yǎng)基滅菌后的pH值（冷卻至室溫25℃測定）。試驗3次。

1.5.2 適用性檢査試驗 每一試驗菌株平行制備2個平皿。同時，用相應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行試驗，并做待檢培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基空白對照。取平均值。分別進(jìn)行3次獨(dú)立試驗。

表1 pH值檢查結(jié)果

表2 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基適用性檢査試驗結(jié)果

表3 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基適用性檢査試驗結(jié)果

2 結(jié)果

各培養(yǎng)基pH值均未超過（規(guī)定值±0.2），均在規(guī)定范圍內(nèi)（玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基pH值未做要求）。菌液回收率=（被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)/對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)）×100%。回收率均在50%～200%范圍內(nèi)。且被檢培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，陰性對照試驗均無菌生長。見表1、表2和表3。

3 討論

3.1 人員操作

檢查過程中任何檢查程序出現(xiàn)操作不當(dāng)[6]，都將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。本試驗進(jìn)行的3次操作分別由接受過相關(guān)培訓(xùn)的不同試驗人員獨(dú)立按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行，確保將人員對試驗影響降到最低[7]。

3.2 培養(yǎng)基的選擇

與2010版藥典相比，2015年版中國藥典對微生物限度檢查的潔凈環(huán)境、培養(yǎng)基及檢查方法進(jìn)行了修訂[8]，修訂后的微生物限度檢查方法與歐美藥典基本一致[9]。其中計數(shù)培養(yǎng)基將營養(yǎng)瓊脂、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，修訂為胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基；并在工藝用水微生物限度計數(shù)中，引入了R2A瓊脂培養(yǎng)基[10]。玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基因其具有的選擇性，仍然保留作為當(dāng)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌使霉菌及酵母菌的計數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求時使用的備選培養(yǎng)基之一[11]。

3.3 滅菌操作

滅菌設(shè)備及參數(shù)對培養(yǎng)基有較大影響，本試驗采用濕熱滅菌法，所使用的高壓滅菌器經(jīng)過性能確認(rèn)，并定期檢定及驗證；滅菌參數(shù)均嚴(yán)格按照各培養(yǎng)基的使用說明進(jìn)行設(shè)定為溫度121℃、壓力0.14 MPa，滅菌15 min。保證培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分不被破壞，避免培養(yǎng)基中其他物質(zhì)因高溫發(fā)生反應(yīng)而影響其質(zhì)量[12]。

3.4 不同培養(yǎng)基的適用性檢查

市場上脫水培養(yǎng)基廠家很多，廠家不同、批號不同，對培養(yǎng)基的質(zhì)量有顯著影響。更換生產(chǎn)商，需重新進(jìn)行驗證。根據(jù)《中國藥典》2015年版四部（9203）規(guī)定，通過本次驗證試驗，培養(yǎng)基的整個配制、滅菌過程受控，每一個批號的脫水培養(yǎng)基只需進(jìn)行一次適用性檢查，更換其他批號培養(yǎng)基也需重新進(jìn)行驗證。

3.5 貯藏條件

2～8℃、避光，所用醫(yī)用冷藏箱定期校驗，只再融化1次并未對培養(yǎng)效果造成明顯影響。若培養(yǎng)基貯藏條件改變需另行驗證貯藏條件、貯藏效期等。

綜上所述，據(jù)試驗結(jié)果，各培養(yǎng)基根據(jù)其包裝上的使用說明制備，121℃、0.14 MPa滅菌15 min，培養(yǎng)基的pH值及適用性檢查均符合規(guī)定，在試驗貯藏期限30 d內(nèi)符合規(guī)定。