彭禮繁 張小建 廖梅旭 李曉潔 余 鯤 龍華洋

四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院輔助生殖醫(yī)學(xué)中心（四川成都 610072）

卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射(Intracytoplasm ic sperm injection，ICSI)受精失敗的原因是多方面的，其主要原因在于卵母細(xì)胞激活不足， 而導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活失敗的首要原因在于精子缺陷， 精子的異常程度直接決定ICSI成功率[1]。 睪丸精子抽取術(shù)（Testicularspiration，TESA）是有創(chuàng)手術(shù)， 且睪丸精子的有無和活力的好壞通常和穿刺部位有關(guān)。 因此， 在進(jìn)行診斷性TESA 時(shí)如果發(fā)現(xiàn)有活動(dòng)精子時(shí)會(huì)及時(shí)把精子冷凍起來， 復(fù)蘇后用于ICSI，可以減少反復(fù)穿刺帶給無精子癥患者生理和心理上的創(chuàng)傷，但由于睪丸精子本身活動(dòng)力低，凍融后會(huì)進(jìn)一步降低睪丸精子的活動(dòng)力， 胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局均不如新鮮睪丸精子。 目前有研究如何從不活動(dòng)的精子中來篩選活精子來提高ICSI 的效率[2]。 也有報(bào)道人工輔助激活卵子技術(shù)（assist oocyte activation，AOA)聯(lián)合ICSI 應(yīng)用于無精子癥患者， 并且獲得臨床妊娠及健康新生兒[3]。 本研究比較了AOA 對(duì)凍融睪丸精子ICSI 后的胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局的影響，旨在解決AOA 的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

2015 年1 月至2019 年12 月就診于我中心行ICSI的不孕周期患者，均獲得患者的知情同意。 男方排除重大疾病和遺傳性疾病，根據(jù)第五版WHO 標(biāo)準(zhǔn)診斷為非梗阻性無精子癥， 對(duì)其采用經(jīng)皮睪丸穿刺精子抽吸術(shù)(Testicular sperm aspiration,TESA）獲得精子，經(jīng)過冷凍復(fù)蘇后用于ICSI。 將這些患者依據(jù)是否添加卵子激活劑CultActive 分為：凍融睪丸精子組(A 組)，使用卵子激活劑CultActive 的凍融睪丸精子組(B 組)，新鮮睪丸精子組(C 組)。

二、方法

（一）促排卵方案

采用常規(guī)長方案超促排卵， 前一月經(jīng)周期的第19～21 日用曲普瑞林 (達(dá)菲林， 法國益普生公司)1.3～1.8mg 降 調(diào) 節(jié)， 月 經(jīng) 第2～3 日 查 血 黃 體 生 成 素(luteinizing hormone releasing hormone, LH) 和雌二醇(Estradiol,E2) 值， 達(dá)充分降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后用果納芬(Gonal-F,瑞士Serono)或麗申寶(中國麗珠公司)促排卵，當(dāng)超聲檢查顯示至少3 個(gè)直徑≥17 mm 的卵泡時(shí)， 當(dāng)日患者接受5 000～10 000 U 的HCG(中國麗珠制藥)以誘發(fā)卵泡成熟，32～36 h 后，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下采卵。

（二）睪丸精子的獲得

患者于局麻下行診斷性TESA 術(shù)，繃緊陰囊皮膚，在睪丸中部用睪丸穿刺抽吸針垂直陰囊皮膚穿刺，利用負(fù)壓吸取少量睪丸組織后并放入培養(yǎng)液中， 在體式顯微鏡下用1m L 注射器針頭將睪丸組織撕碎， 并觀察有無活動(dòng)精子。

（三）睪丸組織的冷凍

按體積比1∶1 加入精子冷凍保護(hù)劑（20%甘油）放于精子冷凍管內(nèi)， 待睪丸組織與精子冷凍保護(hù)劑充分混勻后，在液氮上方懸吊20m in 后投入液氮中冷凍保存。

（四）睪丸組織的復(fù)蘇

女方取卵當(dāng)日，從液氮中取出冷凍管迅速投入37℃水浴10 m in 融解后， 經(jīng)微量梯度離心后將沉淀置于37℃、6%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h 后待用， 若無活動(dòng)精子則采用彭禮繁等[4]的方法選擇活動(dòng)精子行ICSI。

（五）卵子激活劑

CultActive 的使用ICSI 后，用巴士吸管立即將卵子移入含有30μM 卵子激活劑CultActive 中，15m in 后用培養(yǎng)液G-1 充分洗滌2～3 遍后放入新的培養(yǎng)液G-1 液滴中，放入37℃、6%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

（六）受精和胚胎培養(yǎng)

ICSI 后18～19h 后觀察卵胞漿內(nèi)出現(xiàn)2PN 為正常受精，其余為異常受精。受精卵在卵裂培養(yǎng)液(G-1)中繼續(xù)培養(yǎng)至72h 觀察發(fā)育情況，并進(jìn)行胚胎分級(jí)。 以胚胎細(xì)胞數(shù)≥6 個(gè)，卵裂球大小較為均勻，碎片≤20%為可用胚胎。 于取卵后72h 移植，移植胚胎數(shù)目1～2 枚，胚胎移植后給予黃體酮支持黃體。 移植后14 d 左右測血hCG，移植29～31 d 行B 超檢查，發(fā)現(xiàn)孕囊即為臨床妊娠。

三、胚胎的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

按照本中心常規(guī)胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，48 h 發(fā)育為4 細(xì)胞,72h 細(xì)胞數(shù)為7～9 細(xì)胞， 碎片≤15%， 大小稍有差異，即最大的卵裂球與最小卵裂球體積比＜1.5，無多核出現(xiàn)，為第3 天優(yōu)質(zhì)胚胎；72 h 相比48 h 有發(fā)育且細(xì)胞數(shù)4～12 細(xì)胞、碎片程度≤30%，為可利用胚胎。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或率(%)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、患者基本情況比較

三組患者在年齡、不孕年限、促性腺激素用量、促性腺激素使用天數(shù)、獲卵數(shù)上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

二、患者的胚胎發(fā)育情況及妊娠結(jié)局比較

三組患者在年齡、不孕年限、促性腺激素用量、促性腺激素使用天數(shù)、獲卵數(shù)上均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。B 組在2PN 率、 優(yōu)胚率、 可利用胚胎率上均高于A、C組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 三組患者在分裂率上也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 B 組在受精率上明顯高于C 組(P＜0.05)，且顯著高于A 組(P＜0.01)。 B 組在臨床妊娠率上顯著高于A、C 組(P＜0.01)。 見表1。

表1 三組患者臨床資料和胚胎發(fā)育情況比較

討 論

ICSI 借助顯微注射儀直接將精子注射到卵胞漿內(nèi)，繞過了常規(guī)IVF 精子與透明帶的結(jié)合、頂體反應(yīng)、精子與卵細(xì)胞膜的融合等來實(shí)現(xiàn)受精的過程。 ICSI 不僅能使用射出精子， 還能采用附睪或睪丸中的精子來使卵子完成受精和并維持后續(xù)的胚胎發(fā)育， 取得和常規(guī)IVF 一樣的妊娠結(jié)局。 和新鮮精液中的精子相比，睪丸精子成熟度和活動(dòng)能力均有不同程度的下降； 其如果再經(jīng)歷冷凍和復(fù)蘇過程， 其活動(dòng)力和受精能力均會(huì)進(jìn)一步的減弱。

受精是精子和卵子之間相互作用的多步驟、 多分子參與的復(fù)雜過程， 這其中包括了精子獲能、 頂體反應(yīng)、精子穿過卵子透明帶、精子和卵子質(zhì)膜融合、卵子皮質(zhì)反應(yīng)、卵子激活、雌雄原核形成等過程。 受精過程也是配子相互激活的過程，一是卵子對(duì)精子的激活（卵子對(duì)精子的趨化作用、初級(jí)結(jié)合誘導(dǎo)精子的頂體反應(yīng)、穿透并釋放精子激活因子）， 二是精子對(duì)卵子的激活（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的釋放、形成鈣震蕩、皮質(zhì)顆粒反應(yīng)、啟動(dòng)第二次減數(shù)分裂），三是卵子的自身激活（PLC-ζ 水解PIP2、PIP2 分解成IP3， 激發(fā)鈣震蕩、CaMKII 的級(jí)聯(lián)反應(yīng)、CyclinB 降解姐妹單體分離）。ICSI 對(duì)卵子的刺激有以下幾方面[5-6]：一是注射針的機(jī)械刺激，注射精子后適當(dāng)?shù)貙?duì)卵母細(xì)胞胞質(zhì)進(jìn)行抽吸。 針刺進(jìn)入卵母細(xì)胞后會(huì)誘發(fā)單個(gè)Ca2+波動(dòng)，卵母細(xì)胞的酶可以修飾精子膜，釋放一種“鈣振素”使卵子活化，三磷酸肌醇(IP3)和其他第二信使系統(tǒng)被激活；二是注入精子的生物刺激，精子進(jìn)入后也會(huì)發(fā)生一系列的生物反應(yīng)， 進(jìn)而刺激卵母細(xì)胞激活； 三是制動(dòng)精子時(shí)通過注射針的機(jī)械應(yīng)力劃破精子尾部質(zhì)膜，有利于釋放精子中的卵子激活因子。

ICSI 對(duì)卵子的刺激有以下幾方面[3]：一是注射針的機(jī)械刺激， 注射精子后適當(dāng)?shù)貙?duì)卵母細(xì)胞胞質(zhì)進(jìn)行抽吸。 針刺進(jìn)入卵母細(xì)胞后會(huì)誘發(fā)單個(gè)Ca2+波動(dòng)，卵母細(xì)胞的酶可以修飾精子膜，釋放一種“鈣振素”使卵子活化，三磷酸肌醇(IP3)和其他第二信使系統(tǒng)被激活；二是注入精子的生物刺激， 精子進(jìn)入后也會(huì)發(fā)生一系列的生物反應(yīng)，進(jìn)而刺激卵母細(xì)胞激活；三是制動(dòng)精子時(shí)通過注射針的機(jī)械應(yīng)力劃破精子尾部質(zhì)膜， 有利于釋放精子中的卵子激活因子。

ICSI 受精失敗的主要原因在于卵母細(xì)胞激活不足， 而導(dǎo)致卵母細(xì)胞激活失敗的首要原因在于精子缺陷， 精子的異常程度直接決定ICSI 成功率。 有研究表明，位于精子頭部的PLC-ζ 可能是這種卵子激活因子，是影響生殖與男性不育的關(guān)鍵因素[5]。ICSI 受精失敗多是由于精子缺乏卵子激活因子所引起。 有研究發(fā)現(xiàn)，將IVF 和ICSI 均失敗的男性精子注入小鼠卵母細(xì)胞, 不能誘導(dǎo)Ca2+釋放或引發(fā)Ca2+振蕩； 這些精子都同時(shí)表現(xiàn)出了PLC-ζ 異常的現(xiàn)象[6]。 卵子激活決定受精過程能否完成， 而胞內(nèi)鈣離子震蕩則是卵子激活的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。PLC-ζ 可以調(diào)控IP3 介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子的儲(chǔ)存和釋放。 有研究表明，去除精子中PLC-ζ 的活性成分，或者通過siRNA 技術(shù)干擾PLC-ζ 的表達(dá)， 均可顯著降低鈣振蕩水平，甚至可以導(dǎo)致鈣振蕩的提前終止[7]。PLC-ζ表達(dá)的喪失或減少已廣泛用于解釋男性精子激活卵母細(xì)胞反復(fù)失敗而導(dǎo)致的男性不育現(xiàn)象， 其原因可能是PLC-ζ 表達(dá)水平的缺失或減少，造成了PLC-ζ 高度保守區(qū)域的突變[8]。 有研究認(rèn)為，在采用卵子激活處理后，其ATP 含量均較未處理前有了一定的提高， 說明卵子激活可以提高其代謝的ATP 產(chǎn)生水平[9]。 發(fā)生卵母細(xì)胞激活失敗可能是由于注射時(shí)用力過大， 導(dǎo)致卵母細(xì)胞胞質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而使卵母細(xì)胞死亡； 還有可能是未對(duì)精子進(jìn)行適當(dāng)?shù)剡x擇， 注射的精子是形態(tài)不規(guī)則或者死亡的精子， 因?yàn)槠淙狈δ撤N因子或相關(guān)因子生物活性缺乏而使卵母細(xì)胞未被激活導(dǎo)致卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射受精失敗[13]。

卵母細(xì)胞輔助激活 （assist oocyte activation，AOA)技術(shù)能最大程度地模仿精子在受精過程中的活動(dòng)，可以有效彌補(bǔ)精卵結(jié)合時(shí)的卵子激活缺陷， 誘導(dǎo)減數(shù)分裂正常進(jìn)行、雌雄原核形成以及胚胎的進(jìn)一步發(fā)育。 對(duì)于ICSI 受精失敗患者通?？梢越柚鶤OA，即通過物理或化學(xué)的方法使卵胞漿內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)鈣脈沖信號(hào)， 誘導(dǎo)卵子完成減數(shù)分裂可以有效地克服因卵母細(xì)胞激活不足引起的受精失敗或受精率低， 并能獲得正常發(fā)育的胚胎。采用AOA 的方法模擬自然狀態(tài)下精子釋放卵子激活因子引發(fā)鈣離子震蕩可以挽救ICSI 受精失敗，AOA 方法包括機(jī)械刺激 （ICSI 中反復(fù)抽吸卵胞漿）、物理方法（電刺激活化卵子）、化學(xué)方法（乙醇、Ca2+載體、氯化鍶、重組PLC-ζ 等激活卵子）以及蛋白質(zhì)合成抑制劑和蛋白磷酸化抑制劑應(yīng)用等[11-13]。 為改善凍融精子行ICSI 受精率和胚胎發(fā)育， 本研究中采用卵子激活劑CultActive（其有效成分為鈣離子載體A23187）進(jìn)行卵子激活。 卵子激活后明顯提高了卵子的受精率和臨床妊娠率，其優(yōu)胚率和可利用胚胎率也有所提高。

盡管卵子激活的適應(yīng)癥隨著臨床的成功運(yùn)用越來越廣泛，但作為一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)性技術(shù)，AOA 技術(shù)依然存在許多的未知性，其方案和時(shí)機(jī)也有待于進(jìn)一步的探討。 雖然子代安全性研究也未發(fā)現(xiàn)和自然受孕出生嬰兒有差異， 但是仍需要更進(jìn)一步的深入觀察和多中心大樣本的研究。