王奇玲 張欣 宗** 唐 運(yùn)革 鐘愷欣 馬春 杰 陳 曦

1. 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州510600）2. 廣東省計(jì)劃生育科學(xué)技術(shù)研究所男性科；3. 廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院人類精子庫(kù)

人精子低溫冷凍保存技術(shù)常規(guī)應(yīng)用于人類精子庫(kù)， 主要用于供精者捐精精液及有生殖保險(xiǎn)需要的自身精液的冷凍保存[1]。 由于冷凍過(guò)程會(huì)形成冰晶及引起滲透壓的改變，誘發(fā)氧化應(yīng)激并產(chǎn)生過(guò)量活性氧，對(duì)精子產(chǎn)生氧化損傷， 引起精子功能受損以及精子核和精子DNA 受損[2]。 精液冷凍過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）引起質(zhì)膜多不飽和脂肪酸減少， 使膜的液態(tài)性、 流動(dòng)性及通透性發(fā)生改變，造成精子的完整性和運(yùn)動(dòng)性被不可逆地破壞，使其質(zhì)量降低，受精率下降[3]。 為減少冷凍損傷，精液冷凍方法及冷凍保護(hù)劑的選擇至關(guān)重要。如果精液冷凍保存方法合適，精子質(zhì)量不會(huì)隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。 有研究報(bào)道冷凍保存超過(guò)28 年的精子仍能生育子代[4]。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究報(bào)道較少。 隨著二孩政策的全面實(shí)施，之前通過(guò)供精人工授精生育首次生育的部分夫婦使用同一供精精液號(hào)進(jìn)行再次生育。 針對(duì)相同供精者的精液，再次生育時(shí)精液冷凍保存的時(shí)間較首次生育時(shí)的精液更長(zhǎng)。 我們匯總統(tǒng)計(jì)了廣東省人類精子庫(kù)部分精液使用隨訪信息， 分析供精精液不同凍存時(shí)間復(fù)蘇后的精液質(zhì)量及受孕能力，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

資料與方法

一、研究資料

自再次生育政策實(shí)施以來(lái)， 本院生殖中心使用廣東省人類精子庫(kù)供精精液進(jìn)行人工授精治療，共有280對(duì)人工授精夫婦使用之前首次生育時(shí)使用的供精冷凍精液進(jìn)行再次生育。 截至2018 年9 月累計(jì)進(jìn)行541 個(gè)周期。 匯總這些夫婦在首次生育和再次生育時(shí)所用精液的相關(guān)隨訪資料。 541 個(gè)再次生育手術(shù)周期中，有42個(gè)手術(shù)周期采用與首次生育精液相同采集日期， 其余再次生育手術(shù)周期所用精液的采集日期與首次生育精液采集日期相差在3 個(gè)月之內(nèi)。

二、研究指標(biāo)

精液質(zhì)量采用以下3 個(gè)指標(biāo)評(píng)估： 復(fù)蘇后精子濃度（106/m L）；復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比（%）；復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)（106）。 再次生育使用精液與首次生育使用精液的不同凍存時(shí)間采用凍存時(shí)間差（再次生育與首次生育手術(shù)周期的時(shí)間差，按年計(jì)）評(píng)估；精液的受孕能力采用周期妊娠率（再次生育時(shí)使用與首次生育相同供精者精液的全部人工授精周期中， 懷孕周期數(shù)/總的周期數(shù)，%）評(píng)估。

三、研究方法

懷孕信息均由生殖中心以B 超或血HCG 檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)。 精子濃度和前向運(yùn)動(dòng)精子百分比的計(jì)數(shù)均按照《WHO laboratory manual for the Exam ination and Processing of human semen》（第五版）[4]進(jìn)行分析。前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)為精液量、精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子百分比3個(gè)指標(biāo)的乘積。

四、統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)分析用SPSS19.0 軟件完成。描述性分析再次生育所用精液較首次生育受孕精液的凍存時(shí)間差。 再次生育與首次生育手術(shù)周期的復(fù)蘇后精子濃度、 復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比、 復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)的比較采用配對(duì)T 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。 計(jì)算周期妊娠率，周期妊娠率的比較采用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、精液凍存時(shí)間差

541 個(gè)手術(shù)周期，再次生育精液與首次生育精液凍存時(shí)間差最小1.70 年，最大10.84 年，平均相差（5.10±2.04）年。

二、復(fù)蘇后的精液質(zhì)量

再次生育與首次生育精液復(fù)蘇后各參數(shù)結(jié)果如表1 所示。 再次生育精液復(fù)蘇后精子濃度略高于首次生育精液，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；前向運(yùn)動(dòng)精子百分比再次生育精液低于首次生育精液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)再次生育精液略低于首次生育精液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 供精再次生育精液與首次生育精液復(fù)蘇后的精液質(zhì)量比較

再次生育手術(shù)周期采用的精液與首次生育手術(shù)周期采用的精液是同一天采集的，42 個(gè)周期精液復(fù)蘇后各參數(shù)結(jié)果如表2 所示。 再次生育精液與首次生育精液相比，復(fù)蘇后精子濃度、前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 再次生育精液的復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比低于首次生育精液，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 42 個(gè)再次生育周期與首次生育周期使用同一天采集的精液復(fù)蘇后精液質(zhì)量的比較

三、凍存時(shí)間與精液質(zhì)量的關(guān)系

凍存時(shí)間再次生育精液復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比低于首次生育精液， 再次生育精液與首次生育精液的凍存時(shí)間差與前向運(yùn)動(dòng)精子百分比差的相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=0.188，P=0.233）。 隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，精液的前向運(yùn)動(dòng)精子百分比有下降， 但下降的幅度與凍存時(shí)間的長(zhǎng)短無(wú)關(guān)。

四、長(zhǎng)時(shí)間凍存后精液的受孕能力

本研究280 對(duì)夫婦接受了541 周期的人工授精手術(shù)，其中有113 對(duì)夫婦如愿懷孕再次生育，周期妊娠率為20.9%， 與同期該生殖中心的周期妊娠率21.49%（873/4063）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.1019，P=0.7496）。

討 論

隨著輔助生殖技術(shù)成為解決人類生育難題的重要手段， 精子冷凍保存技術(shù)在人類輔助生殖技術(shù)的發(fā)展中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。 冷凍過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)多的ROS 使人精子受到氧化損傷， 復(fù)蘇后的精子其活力和受精率通常低于新鮮精液[3]。 有研究報(bào)道，精子凍融過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)量ROS 可能導(dǎo)致精子頭部頂體脫落、破損、內(nèi)含物丟失，阻礙精卵結(jié)合，從而影響精子的受精功能[5]。 冷凍精子的頂體穿透試驗(yàn)研究結(jié)果提示冷凍保存對(duì)頂體造成損傷，但精子仍能保持活性，頂體素可能未受影響，精子仍具備正常的穿透能力[6]。 來(lái)自日本的研究報(bào)道冷凍精子和新鮮精子相比受精能力并無(wú)明顯下降[7]。 本研究結(jié)果提示，再次生育精液的周期妊娠率為20.9%，與首次生育精液（使用同期的）的周期妊娠率相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 精液凍存時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有降低這些精液的受孕能力。

有研究報(bào)道， 冷凍后精子活力的下降與凍存時(shí)間有非線性的關(guān)系，冷凍6 個(gè)月后的精子，復(fù)蘇后其活力下降的趨勢(shì)基本停止，保留在一定的活力水平[8]。 這是由于精子的代謝活動(dòng)適應(yīng)了冷凍環(huán)境并達(dá)到新的平衡， 精子長(zhǎng)期冷凍保存后仍具有活力。 本研究結(jié)果提示， 精液凍存時(shí)間的延長(zhǎng)可能使復(fù)蘇后的前向運(yùn)動(dòng)精子百分比降低， 但這種降低對(duì)精子的受孕能力沒(méi)有顯著影響。 另一方面，這些長(zhǎng)時(shí)間凍存的精液在保存過(guò)程中由于日常工作中其他精液的移罐、 出庫(kù)等操作可能暴露于空氣中，如果操作不規(guī)范，暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)也可能影響精液復(fù)蘇后的活力。

史雅萍等[9]匯總統(tǒng)計(jì)，2204 個(gè)供精人工授精周期使用的供精精液復(fù)蘇后的精液參數(shù)與周期妊娠率的關(guān)系， 研究結(jié)果提示了復(fù)蘇后精子的活力及前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)不會(huì)影響周期妊娠率，這與精液來(lái)源于供精，精液參數(shù)已在規(guī)定范圍內(nèi)有關(guān)。朱丹丹等[10]對(duì)269 個(gè)人工授精周期的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明， 處理后前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)對(duì)人工授精結(jié)局有影響， 當(dāng)前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)低于5×106時(shí)，臨床妊娠率顯著下降。 本研究結(jié)果提示，隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)， 復(fù)蘇后的前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)沒(méi)有顯著降低，冷凍精液的周期妊娠率沒(méi)有受到影響。

總而言之，隨著凍存時(shí)間的延長(zhǎng)，精子庫(kù)凍存的精液其精子活力雖有降低，但不影響其臨床受孕能力。 精子庫(kù)冷凍精液的質(zhì)量及使用是有保障的。