劉子明 黃定平 朱文平 白培明

廈門大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科（福建廈門 361004）

單側(cè)睪丸扭轉(zhuǎn)（unilateral testicular torsion，UTT）起病隱匿，最常見于青少年，25 歲以下男性發(fā)病率大約為1/4000，是泌尿男科常見的臨床急診之一[1]。目前臨床診療的重點主要在于能否早期診斷以及及時手術(shù)挽救患側(cè)睪丸，以避免出現(xiàn)睪丸壞死/ 切除的嚴重后果；但臨床觀察到仍有相當一部分患者術(shù)后患側(cè)睪丸發(fā)生萎縮，可能對男性生育產(chǎn)生不利影響[2]。 因此有必要對術(shù)后獲救睪丸生精功能進行評估并展開進一步治療措施。 本研究通過建立大鼠UTT 手術(shù)模型，探索環(huán)孢素對術(shù)后睪丸生精功能的保護性影響及其機制， 以期為UTT 臨床術(shù)后治療提供基礎(chǔ)。

材料和方法

一、實驗動物分組

健康SD 雄性大鼠（體重約150-160 g）24 只（購自廈門大學實驗動物中心，SPF 級，許可證號：SYXK（閩）2013-0006），隨機分為假手術(shù)組(S 組)、扭轉(zhuǎn)組（T 組）和環(huán)孢素組（C 組），每組8 只。

二、動物模型的建立

睪丸扭轉(zhuǎn)動物模型參照Turner 法[3]建立。乙醚吸入麻醉，消毒，下腹正中小切口，顯露左側(cè)睪丸，分離筋膜至附睪頭， 扭轉(zhuǎn)組和環(huán)孢素組順時針旋轉(zhuǎn)左側(cè)睪丸720°并維持2h，其間縫合切口。 于復位前15m in 分別腹腔注射生理鹽水0.5m L（扭轉(zhuǎn)組）和環(huán)孢素（5mg/Kg，環(huán)孢素組），其后將扭轉(zhuǎn)睪丸復位并固定于陰囊內(nèi)。 假手術(shù)組扭轉(zhuǎn)720°后立即復位并固定，關(guān)切口。 術(shù)后24h 快速脫頸椎法處死動物，留取手術(shù)側(cè)睪丸。

三、 睪丸組織單細胞懸液制備和流式細胞術(shù)（flow cytometry,FCM）分析

取睪丸組織約500 mg 剪碎，0.25% 胰酶37℃水浴消化30 m in；篩網(wǎng)過濾，濾液離心1500g×5 m in 后去上清；PBS 洗滌2 次后加入AnnexinV-FITC、PI 常溫避光染色10m in，300 目篩網(wǎng)過濾后上機檢測。 流式細胞術(shù)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。 采用FACSC alibur 流式細胞儀（美國BD 公司）對上述生精細胞單細胞懸液進行定量分析，每份樣品檢測104個細胞，記錄散點圖。 在FCM 細胞散點圖中，左上區(qū)表示壞死細胞群；右上區(qū)表示晚期凋亡細胞群；右下區(qū)表示早期凋亡細胞群；左下區(qū)表示正常細胞群。

四、Fas、FasL mRNA 和Bax mRNA 定量分析

應用qRT-PCR 技術(shù)。 用TRIZOL 試劑（生工生物工程有限公司）提取睪丸組織中總RNA。逆轉(zhuǎn)錄總反應體系20 μL， 先是2 ug RNA 與1 μL Oligo (dT) 混勻，70℃變性5 m in，冰上放置5 m in，配置逆轉(zhuǎn)錄相關(guān)的酶和Buffer 共15 μL，并加到5 μL 的RNA 中，25℃5 min，42℃60 m in，70℃15 m in。 按引物設(shè)計原則在Genbank中分別設(shè)計大鼠Fas、FasL、Bax 基因的上游和下游引物（表1）， 引物由閩博生物科技有限公司提供。 以大鼠β-actin 為內(nèi)參照。 qRT-PCR 反應體系20 uL，反應條件為：Fas、FasL、Bax、β-actin 94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)40 次。 進行擴增曲線分析。 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自普洛麥格生物技術(shù)有限公司；qRT-PCR試劑購自艾德萊生物科技有限公司。 qRT-PCR 最終的定量結(jié)果是使用循環(huán)數(shù)即CT 值，依據(jù)2-ΔΔCT 公式計算出各基因與β-actin 的比值。

五、細胞色素C 定量分析

應用Western blot 技術(shù)。 組織裂解液裂解大鼠睪丸組織，離心12000rpm×10 m in，收集上清液，BCA 法測定組織蛋白OD 值，通過標準品制作標準曲線，將OD 值代入標準曲線最終求得組織蛋白濃度， 制備蛋白樣品保存?zhèn)溆谩＜?x SDS Loading buffer，混勻樣品于100℃水浴鍋煮沸10min； 冰上冷卻5min，12000rpm 離心10m in，即可點樣。 以30 μg 蛋白點樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜（采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為95V，60m in）。 5%脫脂奶粉室溫封閉1h，兔抗大鼠細胞色素C （1:1000）4℃振蕩孵育8 h，1×TBST 漂洗3 次后再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1:3000)室溫孵育1 h，采用ECL 顯色并照相記錄結(jié)果。 蛋白裂解液和BCA 蛋白測定試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所。

六、統(tǒng)計學分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件分析， 計量資料使用均數(shù)±標準差(±s)表示，組間檢驗采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 各基因引物序列

結(jié) 果

一、 各組患側(cè)睪丸組織中正常細胞、 早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞、壞死細胞百分比及分布比較

與假手術(shù)組相比，扭轉(zhuǎn)組正常細胞群百分比下降，早、晚期凋亡細胞及壞死細胞群百分比升高，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與扭轉(zhuǎn)組相比，環(huán)孢素組正常細胞群百分比升高，早、晚期凋亡細胞群百分比下降，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）見表2，圖1。

表2 各組正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞百分比（±s）

表2 各組正常細胞、凋亡細胞及壞死細胞百分比（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.01；與扭轉(zhuǎn)組相比，#P＜0.05

組別 n 正常細胞（%） 早期凋亡細胞（%） 晚期凋亡細胞（%） 壞死細胞（%）假手術(shù)組 8 98.29±0.93 0.57±0.12 0.15±0.04 0.98±0.36扭轉(zhuǎn)組 8 77.81±6.52* 16.74±3.16* 2.63±0.57* 2.79±0.68*環(huán)孢素組 8 90.64±7.28# 6.30±1.57# 0.69±0.21# 2.37±0.53

圖1 三組左側(cè)睪丸細胞FCM 散點圖

二、各組Bax、Fas 和FasL mRNA 的表達以及細胞質(zhì)中細胞色素C 定量分析

與假手術(shù)組相比，扭轉(zhuǎn)組Bax、Fas、FasL mRNA 表達上調(diào)，胞質(zhì)中細胞色素C 含量顯著增高，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與扭轉(zhuǎn)組相比，環(huán)孢素組Bax、Fas、FasL mRNA 表達下降， 胞質(zhì)中細胞色素C 含量顯著減少，其差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 見表3，圖2和圖3。

表3 各組Bax、Fas 和FasL mRNA 表達以及細胞色素C 定量分析（±s）

表3 各組Bax、Fas 和FasL mRNA 表達以及細胞色素C 定量分析（±s）

注：與假手術(shù)組相比，*P＜0.01；與扭轉(zhuǎn)組相比，#P＜0.01

組別 n Bax/actin Fas/actin FasL/actin Cytochrome C/β-actin假手術(shù)組 8 0.96±0.06 0.97±0.05 1.01±0.05 0.57±0.27扭轉(zhuǎn)組 8 2.39±0.18* 4.52±0.29* 2.82±0.30* 1.40±0.38*環(huán)孢素組 8 1.38±0.11# 2.31±0.21# 1.57±0.12# 0.70±0.30#

圖2 三組睪丸組織中Bax 、Fas、FasL mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的變化

圖3 三組細胞色素C Western blot 分析

討 論

目前對睪丸扭轉(zhuǎn)術(shù)后患者的隨訪表明[2,4]，即使外科手術(shù)避免了患側(cè)睪丸發(fā)生缺血-壞死，獲救睪丸術(shù)后萎縮率仍達到66.7%，且同時影響生精功能。也就是說，單純手術(shù)治療效果并不理想。 病理生理學研究已經(jīng)證實睪丸扭轉(zhuǎn)/復位術(shù)后發(fā)生的缺血-再灌注損傷是患側(cè)睪丸生精功能受損的主要原因[5]。 這種損傷對睪丸生精功能的影響甚至可能是中長期的， 而且對對側(cè)睪丸生精功能亦可能產(chǎn)生不利影響[6]。 因此，術(shù)后如何進一步減輕睪丸生精功能損傷值得研究。

本課題組之前的系列研究已經(jīng)證實，UTT 術(shù)后缺血-再灌注損傷導致患側(cè)睪丸生精細胞群凋亡明顯增多[7]，其中單倍體細胞群和四倍體細胞群數(shù)量顯著減少[8]。也就是說生精細胞凋亡主要發(fā)生在精子細胞和初級精母細胞，部分精原細胞亦發(fā)生凋亡。 然而當時采用TUNEL 和PI 單染的FCM 技術(shù)觀察生精細胞凋亡存在一定局限，前者定量精確性欠佳，后者則可能因少量壞死細胞混雜于凋亡細胞群出現(xiàn)在凋亡峰中而難以完美區(qū)分。 雖然對研究結(jié)果無重大影響，仍有進一步改進的必要。本研究采用AnnexinV-FITC、PI 雙染技術(shù)，完全區(qū)分了正常細胞、早/晚期凋亡細胞和壞死細胞群。 結(jié)果表明UTT 術(shù)后睪丸生精細胞的損失仍以細胞凋亡為主；雖然扭轉(zhuǎn)組早/晚期凋亡細胞和壞死細胞百分比都較假手術(shù)組明顯增多，但早期凋亡細胞百分比升高仍是生精細胞損失的最主要原因。 FCM 散點圖中可見假手術(shù)組的細胞主要集中于正常區(qū)； 而扭轉(zhuǎn)組早期凋亡區(qū)（右下）細胞分布明顯增多。這也和我們以前的研究結(jié)論相符。 在應用環(huán)孢素干預后，早/晚期凋亡細胞百分比都較扭轉(zhuǎn)組顯著下降， 而壞死細胞百分比并無明顯變化。 這表明，環(huán)孢素早期干預可能通過降低生精細胞凋亡率（而非壞死率），從而減輕UTT 術(shù)后生精損傷。雖然限于觀察期較短，但其短期療效仍值得肯定。

UTT 術(shù)后生精細胞凋亡過程可能存在著內(nèi)源性和外源性兩條基本途徑[8]。 內(nèi)源性途徑以線粒體為中心展開。 通過Bax 介導線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）開放，使線粒體膜間腔內(nèi)細胞色素C 釋放進入胞質(zhì)[9]，從而啟動細胞凋亡程序。 外源性途徑則與細胞膜受體系統(tǒng)（如Fas/FasL）激活有關(guān)，主要通過配-受體的相互作用轉(zhuǎn)導死亡信號[10]。 兩條途徑均可通過進一步引起下游Caspase 家族的“瀑布式級聯(lián)反應”，相繼激活Caspase-8/9和Caspase-3，誘導生精細胞發(fā)生凋亡[11]。

環(huán)孢素對于細胞凋亡內(nèi)源性線粒體途徑的影響在不同器官缺血-再灌注損傷研究中已得到證實。 董建新等[12]發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素抑制線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔開放，減輕了兔小腸缺血-再灌注損傷。 王為等[13]在觀察二硫化碳對大鼠睪丸細胞凋亡的影響時發(fā)現(xiàn)， 細胞凋亡線粒體通路相關(guān)蛋白的表達可能與環(huán)孢素的干預有關(guān)。 本研究顯示，環(huán)孢素干預后Bax mRNA 表達下調(diào)，同時胞質(zhì)中線粒體釋放的細胞色素C 含量降低， 表明環(huán)孢素可能通過抑制細胞凋亡的線粒體途徑減少UTT 術(shù)后生精細胞凋亡。 有意思的是，環(huán)孢素可能也同樣影響了細胞凋亡的膜受體途徑。 本實驗中環(huán)孢素干預后Fas/FasL mRNA 表達下調(diào)，必然會降低細胞凋亡信號的轉(zhuǎn)導，降低細胞凋亡水平。 Baky 等[14]發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素能通過降低FasL 水平發(fā)揮顯著的細胞保護性效應。 王剛等[15]在心肌缺血-再灌注模型中亦發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素預處理能有效減少Fas/FasL 蛋白表達，延緩心肌細胞缺血再灌注損傷，具有保護心肌細胞作用。 這也就是說，環(huán)孢素可能通過調(diào)控多種凋亡相關(guān)基因的表達， 同時對內(nèi)源性和外源性凋亡信號途徑產(chǎn)生影響，減少UTT 術(shù)后生精細胞凋亡，降低睪丸生精損傷。 環(huán)孢素的類似作用在其他細胞凋亡研究中亦得到證實[16]。

本研究仍存在不足之處。雖然實驗結(jié)果顯示環(huán)孢素對大鼠UTT 手術(shù)模型術(shù)后生精功能存在保護性作用，但限于觀察期較短，其長期影響仍有待于進一步探討。