段守興 蔣學(xué)武 張冰娜 肖文峰 謝新泉 張 鏇** 李建宏**

1. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院小兒外科（廣東汕頭 515041）；

2. 南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳坪山婦幼保健院小兒外科（廣東深圳 518122）；

3. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院小兒外科；

4. 汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心

隨著社會的進步與發(fā)展，工業(yè)化程度不斷提高，人類在征服改造自然取得輝煌成就的同時， 由此導(dǎo)致環(huán)境污染與生態(tài)失衡對人類健康， 尤其是生殖健康造成嚴重的影響[1-4]，這可能與孕期暴露環(huán)境雌激素（environmental estrogens，EEs）密切相關(guān)[5-7]。 環(huán)境雌激素對人類雄性生殖健康的影響主要表現(xiàn)在男性先天性畸形如隱睪、尿道下裂、性別發(fā)育異常（DSD）等以及成年后生殖、性功能異常，生殖系腫瘤等[8-10]。 睪丸作為生殖系統(tǒng)的核心器官， 它影響或誘導(dǎo)整個雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育，使得深入研究睪丸正常下降發(fā)育的影響因素尤為重要。

睪丸的正常發(fā)育需經(jīng)歷兩個正常的下降階段，在睪丸下降第一階段（經(jīng)腹下降期），睪丸引帶特征性地表現(xiàn)細胞增殖、分化、遷移、收縮及激素代謝等功能[11]。目前公認在睪丸下降發(fā)育第一階段起關(guān)鍵作用的調(diào)控因子——胰島素樣因子3（Insulin-Like Factor 3，INSL3）能刺激睪丸引帶增生，控制其生長發(fā)育[12-14]。INSL3 通過與其特異受體松弛素家族肽受體2（Relaxin fam ily peptide receptor 2,RXFP2）結(jié)合形成INSL3-RXFP2 配體受體復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)作用[15,16]。 既往研究發(fā)現(xiàn)EEs 可不同程度的抑制胚胎期睪丸Leydig 細胞生成INSL3，從而影響睪丸下降發(fā)育， 并推測這個過程是進一步影響睪丸引帶的形態(tài)及功能間接實現(xiàn)的[17]。 但EEs 對睪丸引帶發(fā)育影響的確切作用機制卻并不十分清楚。 目前EEs 對INSL3 影響方面的研究已有不少報道[13,18]，但對其特異性受體RXFP2 是否有直接影響的報道尚缺乏。

為了明確EEs 影響睪丸引帶發(fā)育是否與RXFP2 直接相關(guān)。 本研究利用經(jīng)典EEs 己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）進行染毒，觀察DES 對培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)、增殖性和RXFP2 的影響，探討RXFP2 在外源性雌激素影響小鼠睪丸引帶發(fā)育中的可能作用機制，為闡明EEs 的生殖毒性作用機制提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

（一）實驗動物

8～10 周齡昆明小鼠購自并飼養(yǎng)于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心（SPF 級別）。按雌雄比例2∶1 合籠，懷孕生產(chǎn)后取新生仔鼠用于實驗。

（二）主要試劑

DES（美國Sigma 公司）；高糖不含酚紅的DMEM（德國Applichem 公司）；不含雌激素的胎牛血清（以色列Biological 公司）； DMSO （中國上海生工）；CCK-8（日本Dojindo 公司）；臺盼藍（美國Sigma 公司）；DAPI（中國碧云天公司）； 山羊抗小鼠RXFP2 多克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；異硫氰酸熒光素(FITC)一兔抗山羊IgG（中國武漢博士德生物工程有限公司）。

（三）主要儀器

手術(shù)放大鏡（中國天津醫(yī)學(xué)光學(xué)儀器廠）；手術(shù)顯微器械（中國上海金鐘手術(shù)器械廠）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；熒光顯微鏡（德國Leica 公司）；ELx800 酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP 公司）。

二、方法

（一）小鼠睪丸引帶細胞的培養(yǎng)及分組

脫頸椎處死新生小鼠， 在3 倍手術(shù)放大鏡下取出小鼠睪丸引帶組織。 將引帶組織放入含Ⅰ型膠原酶（1mg/m L）的DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃持續(xù)振蕩消化1h 后，加入3～4 倍含無雌激素血清的培養(yǎng)液終止消化作用； 靜置后取上清液， 用25μm 孔徑過濾器過濾，以1 000 r/m in 離心濾液5 m in（離心半徑為15 cm），棄上清。 細胞沉淀加入含無雌激素胎牛血清（體積分數(shù)為10%）的DMEM 培養(yǎng)液，吹打成單細胞懸液，接種于25 m L 培養(yǎng)瓶中， 置于5% CO2、37 ℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)。 傳代細胞隨機分為正常組、溶劑對照組和實驗組（DES 0.01、0.10、1.00、10.00 μg/m L 4 個劑量組）。

（二）小鼠睪丸引帶細胞計數(shù)及存活率的檢測

對細胞傳代時的細胞懸液進行計數(shù)。 用酒精沖洗計數(shù)板后，把蓋片覆在計算板上，取少許混勻的細胞懸液加入計數(shù)板和蓋片間的間隙中， 置相差顯微鏡下觀察，可見細胞均勻分散于各處。 計算四角大格內(nèi)的細胞數(shù)，壓中線者只計左側(cè)和上方者，右方和下方不計算在內(nèi)。 然后按下式計算：細胞懸液濃度（細胞個數(shù)/m L）≈（4 個大方格細胞總數(shù)/4)×10 000×稀釋倍數(shù)。

用臺盼藍染細胞時，活細胞拒染，死細胞可攝取染料變藍。 利用細胞這種特性，我們使用臺盼藍對傳代的細胞懸液進行細胞活性檢測。 取混勻的細胞懸液和0.2%臺盼藍（9∶1）充分混合，置2～3m in。 取10μl 細胞懸液后加入至計數(shù)板與蓋片間的間隙中。 置倒置顯微鏡下觀察，凡著色的細胞均為不健康的或已死細胞，活細胞不著色。 計算四角大格內(nèi)的細胞數(shù)（同細胞計數(shù)）然后按下式計算： 細胞活性（%）≈[活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)＋死細胞數(shù)）]×100%

（三）CCK-8 法細胞增殖抑制檢測

將制備好的細胞懸液種于96 孔板中（邊緣一圈不接種），每組設(shè)9 個平行孔，重復(fù)3 次。 實驗組加入不同劑 量 的DES （終 濃 度 分 別 為0.01、0.10、1.00、10.00 μg/m L）各1 μl，溶劑對照組加入DMSO1 μl，正常組不加任何藥物。 加藥后48 h 進行CCK-8 的檢測。 每孔加入10 μl 的CCK-8 后，避光置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h。使用酶標儀雙波長（檢測波長為450 nm 和630 nm）測定每孔的吸光度值，以代表細胞的增殖性。

（四）細胞免疫熒光檢測

選擇傳代1～2 d、長滿單層、形態(tài)良好的細胞，去除培養(yǎng)基，分別加入終濃度為0 （溶劑對照）、0.01、0.10、1.00、10.00 μg/m l 含DES 的培養(yǎng)液1 μl， 并設(shè)正常對照（不加任何藥物）。 繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，將獲取的細胞蓋玻片用PBS 輕洗，4%多聚甲醛固定15 min，PBS 輕洗3 遍，1%BSA 覆蓋片刻， 滴加濃度為1∶100 的山羊抗小鼠RXFP2 多克隆抗體（一抗），置濕盒內(nèi)4℃過夜，再用PBS 輕輕洗滌3 遍后，滴加1∶500 FITC- 兔抗山羊IgG（二抗），在室溫中孵育60m in ，PBS 輕輕洗滌3 遍，加入DAPI 染核5 min。 甘油封片，熒光顯微鏡下觀察,拍片。

（五）Western Blot 分析

取各組睪丸引帶細胞加入RIPA 蛋白酶裂解后取上清液獲取蛋白， 取一定的蛋白量進行SDS-PAGE 電泳，硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗山羊抗小鼠RXFP2 多克隆抗體（1∶100）在4℃冰箱內(nèi)過夜孵育，二抗（HRP 一兔抗山羊IgG 1：500） 室溫下孵育1～2 h后，進行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，顯影，定影。 最后將膠片進行掃描或拍照， 用Image-pro 軟件分析目標條帶光密度值。以測定蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示其蛋白相對表達水平，實驗重復(fù)3 次，取其平均值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以x±s 表示，應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件分析，樣本率采用卡方檢驗，多組比較采用方差齊性檢驗和單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較時，采用兩獨立樣本t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、DES 對小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)的影響

正常組與溶劑對照組培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞大部分為成纖維樣細胞，有少數(shù)的上皮樣細胞。 胞體呈梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)有突起（圖1 A,B）。 實驗組細胞隨DES 劑量增加明顯受抑制，細胞生長緩慢，突起回縮，相互間隙增大（圖1 C,D,E,F）。 DES 劑量越高，細胞越失去成纖維細胞的形態(tài)，細胞漿收縮，胞體呈不規(guī)則類橢圓型（圖1 F）。

圖1 DES 對小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)的影響

二、DES 對小鼠睪丸引帶細胞增殖性的影響

正常細胞傳代后仍呈成纖維細胞型生長， 同源性好，存活率可達90%。各實驗組隨DES 劑量增加細胞數(shù)及細胞生存率均下降（P＜0.001）(圖2 A)。正常組細胞呈持續(xù)性增殖，溶劑對照組無明顯差異。 實驗組與正常組對比均有不同程度的增殖抑制(P＜0.05 或P＜0.001)，以DES 10 μg/m l 組抑制最明顯（P＜0.001）(圖2 B)。 表明DES 對睪丸引帶細胞增殖性有抑制作用，并存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖2 DES 對小鼠睪丸引帶細胞生長及增殖情況的影響

三、RXFP2 的亞細胞定位及DES 對小鼠睪丸引帶細胞RXFP2 表達的影響

我們使用細胞免疫熒光方法顯示RXFP2 表達于細胞膜上，熒光強度較高（圖3）。 通過Western Blot 結(jié)果發(fā)現(xiàn)正常組和溶劑對照組小鼠睪丸引帶細胞上的RXFP2 表達無明顯差異（P＞0.05），各實驗組中RXFP2表達明顯降低（P＜0.001）（圖4）。

圖3 免疫熒光對RXFP2 的亞細胞定位

圖4 Western Blot 檢測DES對小鼠睪丸引帶中RXFP2 表達的影響

討 論

環(huán)境雌激素又稱外源性雌激素， 是人體外化學(xué)物質(zhì)中具有雌激素樣活性， 并可破壞人體內(nèi)分泌平衡引起一系列臨床后果的物質(zhì)， 廣泛存在于自然界和人們的日常生活中[6,19]。無論動物實驗還是流行病學(xué)方面的研究都顯示EEs 能引起多種泌尿生殖系統(tǒng)異常/畸形[20,21]。美國國家環(huán)境衛(wèi)生科學(xué)研究所 （National Institute of Environmental Health Sciences）的實驗室將DES 作為用來研究EEs 效應(yīng)的參考雌激素[22]。 因此， 本研究選擇DES 作為我們研究EEs 生殖毒性的干預(yù)手段。

小鼠睪丸下降第一階段（經(jīng)腹下降期）發(fā)生于胎鼠期，睪丸引帶在此階段特征性地表現(xiàn)細胞增殖、分化、遷移、收縮及激素代謝等功能，引帶細胞收縮活性與引帶形態(tài)變化相互協(xié)調(diào)[23]。我們對培養(yǎng)的小鼠睪丸引帶細胞進行單一的干預(yù)因素作用， 發(fā)現(xiàn)DES 可致小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)異常、結(jié)構(gòu)紊亂，隨著DES 劑量的增加，細胞失去原有形態(tài)，并與劑量有關(guān)。提示DES 對小鼠睪丸引帶細胞有顯著的細胞毒性作用， 可以抑制小鼠睪丸引帶細胞的生長與發(fā)育。

睪丸下降發(fā)育是一項非常復(fù)雜的系統(tǒng)工程， 要經(jīng)歷兩個下降過程， 涉及很多影響或調(diào)控睪丸下降發(fā)育的因素[24,25]。目前已比較明確的是INSL3 在睪丸下降的第一階段起著決定性作用，INSL3 與RXFP2 結(jié)合形成受體配體復(fù)合物INSL3-RXFP2 發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15,16]。我們確定了DES 對小鼠睪丸引帶發(fā)育的影響， 但具體的作用機制仍不清楚[26]。

通過本研究，我們發(fā)現(xiàn)RXFP2 高表達于睪丸引帶中，并主要分布在細胞膜上。 DES 作用后RXFP2 蛋白表 達 降 低，DES 劑 量 越 大，RXFP2 表 達 越 低。 由 于RXFP2 是睪丸下降發(fā)育第一階段關(guān)鍵調(diào)控因素INSL3的特異性受體，且兩者需形成INSL3-RXFP2 復(fù)合物方可發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[15,16]。 RXFP2 表達量的降低將使得INSL3 減少了發(fā)揮生物效應(yīng)的媒介，減少了相互結(jié)合，從而使睪丸經(jīng)腹下降期受阻[27]。因此，我們推測DES 對睪丸引帶細胞形態(tài)及增殖性的影響可能是通過RXFP2起作用，提示RXFP2 可能介導(dǎo)了DES 影響睪丸引帶發(fā)育的過程。

綜上所述， 通過本研究我們驗證了DES 可引起小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)與增殖異常， 并進一步檢測了DES 可以降低睪丸引帶中RXFP2 的表達。 提示DES對睪丸引帶的影響可能是通過RXFP2 信號系統(tǒng)介導(dǎo)的， 為更全面地研究外源性雌激素影響生殖系統(tǒng)發(fā)育的可能途徑提供理論基礎(chǔ)。