馬 越，彭 帥，陳 朗，王馨敏，劉麗霞*

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannanbinding lectin, MLB）它的別名是甘露聚糖結(jié)合蛋白，膠凝素家族的成員中就有它的存在。MBL的本質(zhì)是糖蛋白，由肝臟細(xì)胞合成MBL后進(jìn)入到血液循環(huán)中的基因。MBL在機(jī)體天然免疫防御系統(tǒng)中有重要的意義，提高機(jī)體的抗病性必須要保證MBL在體內(nèi)的濃度有著較高的水平才能達(dá)所需目的。甘露聚糖結(jié)合凝集素2（mannanbindinglectin2,MLB2）基因是MBL基因的一種，豬的MBL2基因位于14號(hào)染色體，有4個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子[1]。研究表明MBL2在控制豬的疾病方面有很重要的作用，通過(guò)使用同源建模和折疊識(shí)別的方法可以構(gòu)建MBL2蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)而研究出兩個(gè)蛋白質(zhì)之間相互作用情況，進(jìn)而有效地控制異種病毒的傳播[2]。程少文等[3]研究通過(guò)構(gòu)建MBL2蛋白與MASPS家族蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)得到MBL2基因在補(bǔ)體系統(tǒng)激活及機(jī)體免疫防御等方面發(fā)揮重要的作用。夏銘崎等[4]研究表明免疫疫苗也可以控制PRRS的致病性，通過(guò)將基礎(chǔ)種子接種到患有豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）健康且易感染的仔豬，在豬體內(nèi)連續(xù)傳五代以驗(yàn)證毒力返強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)是否存在于該疫苗株中。通過(guò)構(gòu)建載體得到重組蛋白進(jìn)而建立試劑盒用以檢測(cè)PRRSV血清抗體，結(jié)果表明血清抗體與豬病毒性傳染病特異性良好，可有效用于流行性病毒的研究[5]。劉玉芬等[6]研究表明哈白豬MBL與人類(lèi)MBL在功能上的相似性，可以為用豬MBL代替人MBL來(lái)治愈患有甘露聚糖結(jié)合凝集素缺陷的人類(lèi)疾病提供條件基礎(chǔ)。袁焰平等[7]研究表明PRRS與MBL2基因有關(guān)連，PRRS屬于動(dòng)脈炎病毒屬，可以使懷孕母豬流產(chǎn)、死胎甚至影響后代，為進(jìn)一步研究豬藍(lán)耳病提供了有力的依據(jù)。

近年來(lái)傳染病對(duì)豬的危害范圍越來(lái)越廣泛，包括外界因素和自身等因素，然而豬繁殖與呼吸綜合征是目前養(yǎng)豬業(yè)危害最大、控制最難的傳染病之一。因此，近年來(lái)有關(guān)豬繁殖與呼吸綜合征的防治、抗病育種和提高豬自身抗病力正在進(jìn)行進(jìn)一步的研究。該研究利用生物信息學(xué)分析的方法得出結(jié)論，可為MBL2基因作用機(jī)理的深入研究與控制豬的疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 豬MBL2基因序列

從GenBank中查找已公布的豬MBL2基因編碼區(qū)全長(zhǎng)序列（登錄號(hào)：NM_214125.1）。

1.2 生物信息學(xué)分析

對(duì)豬的MBL2基因CDS區(qū)編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)并且分析、對(duì)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能以及理化性質(zhì)也要進(jìn)行預(yù)測(cè)并分析，實(shí)驗(yàn)用的網(wǎng)址和軟件如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)測(cè)并分析了豬的MBL2基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

表1 豬MBL2 基因生物信息學(xué)主要分析軟件

表2 豬MBL2 基因編碼蛋白質(zhì)理化特性

利用E x P A S y 的在線程序Protparam預(yù)測(cè)豬MBL2基因的理化特性，其中包括蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)和氨基酸組成等（如表2）。豬MBL2基因共編碼240個(gè)氨基酸，圖1為20種氨基酸所占比例，甘氨酸（GLY）所占比例是最大的，占組成整個(gè)氨基酸的12.9%，組氨酸（HIS）、酪氨酸（TYR）和色氨酸（Trp）這3個(gè)氨基酸所占比例是最少的，每1個(gè)都只占1.2%?；蚓幋a產(chǎn)物穩(wěn)定指數(shù)為33.35。

2.1 預(yù)測(cè)并分析出豬的MBL2基因編碼蛋白質(zhì)的親、疏水性

在計(jì)算機(jī)上找到E x p a s y 服務(wù)器，然后運(yùn)用該服務(wù)器上面的Protscale程序?qū)Φ呢iMBL2基因編碼蛋白質(zhì)的疏水性警醒預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖2）表明此蛋白質(zhì)第615和616位異亮氨酸（Ile）疏水性為＋1.867，由此可見(jiàn)其疏水性之強(qiáng)，然而位于102位的谷氨酸（Glu），它的親水性為-0.356，我們可以得到它的親水性是最強(qiáng)的?？傮w平均值為-0.317，所以呈親水性。

2.2 預(yù)測(cè)并分析出豬的MBL2基因編碼蛋白的N-糖基化位點(diǎn)

通過(guò)使用C B S 分析軟件NetNGlyc 1.0對(duì)該基因編碼蛋白的N-糖基化位點(diǎn)實(shí)行了預(yù)測(cè)（如圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)在豬的MBL2基因編碼蛋白質(zhì)，它們分別是Asn96、Asn260、Asn369以及Asn31。

2.3 豬MBL2基因編碼蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析

對(duì)豬的MBL2基因編碼蛋白質(zhì)是否存在信號(hào)肽進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖4，MBL2基因編碼蛋白質(zhì)的分值曲線相對(duì)典型，其中C值與S值接近0.4，20-21位的氨基酸之間存在切割位點(diǎn)，剪切位點(diǎn)前Y值較高，剪切位點(diǎn)后Y值變低。由此可以判定豬MBL2基因編碼蛋白質(zhì)存在信號(hào)肽。

2.4 預(yù)測(cè)豬MBL2基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)及分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈主鏈折疊產(chǎn)生的由主鏈內(nèi)和主鏈間周期性氫鍵維系的有規(guī)則構(gòu)象為蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些構(gòu)象借助各種次級(jí)鍵共同構(gòu)成其三級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，而對(duì)蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析對(duì)了解蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的相關(guān)性有著極其重要的意義。對(duì)豬MBL2基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖5，由此可知在二級(jí)結(jié)構(gòu)組分中Hh＜45%，Ee＜20%，α-螺旋（Hh）占23.33%，β-折疊（Ee）占13.75%，無(wú)規(guī)則卷曲(Cc)占62.92%。圖6為其三級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 討論

近年來(lái)有研究表明MBL2基因多態(tài)性與豬的肺炎、豬藍(lán)耳病、腸道等疾病有關(guān)聯(lián)。有關(guān)報(bào)道講述在蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中的速率和蛋白質(zhì)加工過(guò)程中的立體結(jié)構(gòu)可能是因MBL2基因的影響，導(dǎo)致該基因蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生穩(wěn)定性差異。在豬的多種組織器官中均能發(fā)現(xiàn)MBL2基因表達(dá)的影響結(jié)果，在肝臟中基因的表達(dá)量最高，MBL2基因可以合成MBL-C蛋白，多種真菌、細(xì)菌、病毒的表面糖基均可以與該基因結(jié)合，并通過(guò)MBL途徑激活補(bǔ)體啟動(dòng)機(jī)體的天然免疫機(jī)制，從而達(dá)到殺滅或是清除病原體的作用，另外該蛋白還具有介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)和吞噬的作用[9-10]。MBL2作為MBL的家族成員之一，MBL與C1有相同的四級(jí)結(jié)構(gòu)，可以激活補(bǔ)體、調(diào)理吞噬作用，產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫效應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外已有大量研究表明，大多數(shù)動(dòng)物體內(nèi)都具有M B L 2 基因，用來(lái)編碼M B L-C蛋白，在豬、牛、恒河猴、短尾猴、大鼠、小鼠體內(nèi)都分離到了MBL蛋白。

研究分析了MBL2基因的結(jié)構(gòu)及功能，通過(guò)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽、糖基化位點(diǎn)和mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)得到相應(yīng)結(jié)果。預(yù)測(cè)結(jié)果可以看出，MBL2蛋白是由240個(gè)氨基酸組成的不穩(wěn)定親水性可溶性蛋白質(zhì)。豬MBL2蛋白理論等電點(diǎn)為4.97，由此可判斷豬MBL2蛋白是一種酸性蛋白質(zhì)。豬MBL2蛋白半衰期為30 h，通常蛋白質(zhì)半衰期越長(zhǎng)其結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，豬MBL2蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為33.35，屬于穩(wěn)定蛋白。依據(jù)總平均親水性（-0.317），可判斷豬MBL2蛋白是可溶性蛋白。豬MBL2蛋白無(wú)跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，可能與MBL2蛋白氨基酸序列較短有關(guān)。豬MBL2蛋白具有4個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，可能與其抗病性有關(guān)聯(lián)。mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲（Cc）占比62.92，因此判斷豬MBL2基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲型[11-13]。

該研究系統(tǒng)地對(duì)豬MBL2蛋白的理化性質(zhì)及基本結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，揭示了模式識(shí)別受體MBL2理化特性，為深入探究豬MBL2基因的功能、作用機(jī)理、抗病育種以及豬藍(lán)耳病提供了理論基礎(chǔ)。