翁朝紅 謝仰杰 肖志群 王志勇

中國鱟()微衛(wèi)星標記篩選及種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析*

翁朝紅 謝仰杰①肖志群 王志勇

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室 廈門 361021)

采用FIASCO方法構(gòu)建了中國鱟()(CA)微衛(wèi)星富集文庫, 對214個陽性克隆進行測序, 篩選獲得60條含有微衛(wèi)星的序列, 其中可設(shè)計引物的序列共38條。38對微衛(wèi)星引物在37個中國鱟個體中PCR檢測發(fā)現(xiàn), 只有9個位點具有多態(tài)性, 其等位基因數(shù)為5—14個, 每個位點平均具有8.1個等位基因。9個位點之間不存在連鎖。利用該9個具有多態(tài)性微衛(wèi)星標記分析了中國沿海9個中國鱟地理群體的種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明: 中國沿海的中國鱟種群遺傳多態(tài)性水平仍較高, 9個地方群體間無遺傳差異, 它們之間未見顯著分化, 且有著較高的基因流; 推測人為的遷移是造成遺傳無分化的主要原因。我們建議中國鱟已絕跡的海域可從其他海域引入中國鱟個體來恢復(fù)地方群體資源。

中國鱟; 微衛(wèi)星標記; FIASCO; 遺傳多樣性; 遺傳結(jié)構(gòu)

中國鱟()隸屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)、鰲肢亞門(Chelicerata)、肢口綱(Merostomata), 為現(xiàn)存僅有4種鱟之一。鱟具有重要的藥用價值和食用價值, 由其血細胞溶解液制備的鱟試劑為目前用于檢測內(nèi)毒素的常規(guī)試劑, 應(yīng)用廣泛, 如應(yīng)用于臨床檢驗、醫(yī)藥行業(yè)和食品加工業(yè)等各個領(lǐng)域(顏明艷等, 2018); 鱟被沿海民眾視為海鮮美食甚至滋補品或藥用, 食鱟文化已有上千年歷史記載(廖永巖等, 1998)。中國鱟為亞洲3種鱟中分布最廣、經(jīng)濟價值最大的一種。30—40年前, 中國鱟曾廣泛分布于北至長江口、南到北部灣的中國沿海海域(Sekiguchi, 1988; 廖永巖等, 2006; 翁朝紅等, 2012)。但近幾十年來由于鱟試劑生產(chǎn)和海鮮美食的旺盛需求使中國鱟遭遇酷漁濫捕(翁朝紅等, 2012), 而沿海經(jīng)濟的快速發(fā)展和人口劇增, 因填海造地、海洋工程發(fā)展以及旅游用地需要, 使潮間帶幼鱟棲息地遭受嚴重破壞和環(huán)境污染, 導(dǎo)致中國鱟已在中國東南沿海許多海域銷聲匿跡, 分布范圍在急速縮小, 分布區(qū)片段化。種群個體數(shù)量下降的同時, 往往引起遺傳多樣性下降, 也導(dǎo)致近交發(fā)生和有害等位基因固定, 這些因素引起物種適應(yīng)力下降, 也將導(dǎo)致物種滅絕可能性增加(Bush, 2011)。因此中國鱟資源亟待保護。

微衛(wèi)星標記(microsatellite, SSR)由于在基因組中數(shù)量大、多態(tài)性高、共顯性、等位基因多、靈敏度高、在檢測中操作簡便、結(jié)果可靠、通用性好等多方面優(yōu)點, 已廣泛應(yīng)用于海洋動物種群遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建(Yu, 2015; Cao, 2017; Zhao, 2019)。目前有關(guān)中國鱟微衛(wèi)星標記的開發(fā), Nishida等(2010)通過采用PIMA (PCR Isolation of Microsatellite Array)方法, 用載體通用引物和另一條為復(fù)合微衛(wèi)星序列的引物PCR篩選含有復(fù)合微衛(wèi)星的序列, 獲得8個多態(tài)性SSR標記, 等位基因數(shù)為2—4, 多態(tài)性不高; Li等(2009)通過FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats)法篩選了8個多態(tài)性微衛(wèi)星位點。

種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性信息是制定中國鱟保護和管理策略的基礎(chǔ)和理論依據(jù), 因此有必要分析中國海域中國鱟的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性特點, 掌握充分的中國鱟種群遺傳信息, 才能更科學(xué)合理地制定保護管理措施。

本研究采用FIASCO法構(gòu)建中國鱟(CA)微衛(wèi)星富集文庫, 通過克隆、測序、設(shè)計引物和PCR檢驗以獲得多態(tài)性微衛(wèi)星標記; 利用這些SSR標記分析中國海域中國鱟的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)特點, 以期了解中國海域的中國鱟是否存在亞居群(顯著分化的群體), 確定是否存在進化顯著單元(ESU), 這些信息將為科學(xué)合理地制定中國鱟的保護管理措施提供必要的理論參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

中國鱟樣品分別從以下9個采樣點的臨近海域采集: 浙江寧海(NH)、浙江溫州(WZ)、福建連江(LJ)、福建平潭(PT)、福建湄洲島(MZ)、福建漳浦(ZP)、廣東湛江(ZJ)、廣西北海(BH)、海南儋州(DZ)等(采樣點信息見圖1和表1)。取附肢肌肉置于95%乙醇中固定, 于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中國東南沿海中國鱟9個采樣地信息

Tab.1 The information of nine sampling sites of T. tridentatus from southeast coast of China

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取及檢測 所有樣品的基因組DNA采用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿抽提方法提取。獲得的基因組DNA通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量, 紫外分光光度計OD260測定其DNA濃度。

1.2.2 微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建 微衛(wèi)星富集文庫構(gòu)建利用FIASCO (Fast Isolation by AFLP Sequences Containing Repeats)方法(Bloor, 2001; Zane, 2002)?；蚪MDNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶I酶切后, 使用T4 DNA連接酶進行接頭連接, 并使用I primers對連接產(chǎn)物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)變性后, 與生物素標記的(CA)15探針雜交, 進行微衛(wèi)星片段的捕獲。以獲得的含有微衛(wèi)星片段的目的DNA片段為模板, 進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物與pMD18-T (TaKaRa)載體連接, 純化后的載體連接產(chǎn)物通過電轉(zhuǎn)化到已制備好的感受態(tài)細胞, 最終得到中國鱟微衛(wèi)星文庫。

1.2.3 克隆篩選、陽性克隆測序和引物設(shè)計 用M-13載體通用引物進行PCR擴增, 挑取陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。對測序結(jié)果進行人工分析, 去除載體和接頭序列, 挑選含有微衛(wèi)星的序列, 并用Premier 5.0軟件設(shè)計引物, 并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.4 微衛(wèi)星多態(tài)性檢測和序列特征分析 對微衛(wèi)星引物PCR條件進行優(yōu)化, 并在37個中國鱟個體中進行多態(tài)性檢測。PCR產(chǎn)物采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

利用Genepop 4.0.1.0軟件(Rousset, 2008)檢測每個微衛(wèi)星座位偏離Hardy-Weinberg平衡和9個微衛(wèi)星座位兩兩之間連鎖不平衡(LD)情況; 利用Arliquin 3.1計算每個位點等位基因數(shù)、觀測雜合度(o)和期望雜合度(e)。啞等位基因(null alleles)及其頻率通過MICRO-CHECKER 2.2.3軟件檢測和計算(Van Oosterhout, 2004)。利用Cervus 2.0軟件(http:// helios.bto.ed.ac.uk/evolgen)分析多態(tài)性信息含量(polymorphic information content, PIC)。

1.2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

(1) PCR擴增和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用具有多態(tài)性微衛(wèi)星引物對以上9個中國鱟群體進行擴增, PCR反應(yīng)體系總體積為 20μL, 包括: 10×Buffer 2μL, dNTPs 1.6μL, Primer F (10mmol/L) 0.5μL, Primer R (10mmol/L) 0.5μL,(TaKaRa) 0.2μL, DNA 1.0μL。PCR 程序為: 94°C預(yù)變性2min, 94°C變性20s,m(根據(jù)不同引物而定)退火20s, 72°C延伸30s, 共35個循環(huán), 72°C延伸7min, 4°C保存。PCR產(chǎn)物采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

(2) 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Cervus 2.0軟件計算基因頻率, 分析遺傳多樣性特點(包括雜合子數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)性信息含量), 每個位點經(jīng)適合度卡方檢驗確定是否符合Hardy-Weinberg平衡。根據(jù)Summers等(1997)計算法計算各個微衛(wèi)星位點的啞等位基因(null allele)頻率。利用Popgene 1.31軟件分析中國鱟各群體遺傳多樣性系數(shù), Nei遺傳相似度和遺傳距離。利用3.1進行群體遺傳分化和AMOVA分析, 并運用Structure 2.2軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星標記篩選結(jié)果

通過FIASCO方法進行中國鱟微衛(wèi)星富集文庫構(gòu)建, 共獲得陽性克隆2020個, 從中隨機挑取300個陽性克隆進行PCR檢測, 對214個陽性克隆進行測序, 共獲得60條含有微衛(wèi)星的序列, 微衛(wèi)星陽性比例為28.04%。其中完美型的占71.1%, 非完美型的為10.5%, 復(fù)合型的占18.4%。其中可設(shè)計引物的序列有38條。

2.2 具多態(tài)性的微衛(wèi)星位點特征分析

38對SSR引物在37個中國鱟個體中進行多態(tài)性檢測。PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn), 12對引物無擴增產(chǎn)物, 17對引物無多態(tài)性, 9對引物多態(tài)性較高。

9個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)為5—14個, 每個位點平均等位基因數(shù)為8.1; 多態(tài)信息含量(PIC)為0.287—0.885, 平均為0.637, 除了位點WTT9外, 其他位點都高于0.4, 可見這些多態(tài)性微衛(wèi)星位點具有較高的多態(tài)性; 觀測觀雜合度為0.189—0.784, 期望雜合度為0.297—0.906 (表2)。經(jīng)檢測只有2個位點(WTT1和WTT8)未偏離Hardy-Weinberg平衡(>0.05), 而其他7個位點(WTT2, WTT3, WTT4, WTT5, WTT6, WTT7, WTT9)明顯偏離Hardy-Weinberg平衡(<0.05)。連鎖不平衡檢測結(jié)果表明這9個位點之間不存在連鎖關(guān)系(>0.05)。啞等位基因頻率計算和檢驗結(jié)果表明, 除了位點WTT1和WTT8不存在啞等位基因外, 其他位點都存在啞等位基因(啞等位基因頻率都大于0.12), 且這些位點顯示偏離Hardy-Weinberg平衡。啞等位基因的存在可能是這些位點偏離Hardy-Weinberg平衡的主要原因。MICRO-CHECKER檢驗結(jié)果表明9個SSR位點都未有大的等位基因遺失現(xiàn)象(large allele dropout)。固定指數(shù)is除了位點WTT8為負數(shù)外, 其他位點都大于0, 表明這些位點存在雜合體缺失, 這可能也是引起偏離Hardy-Weinberg平衡的另一重要原因。

2.3 中國鱟群體遺傳多樣性

中國鱟9個群體中, 每位點平均等位基因數(shù)()為4.71—8.14, 每個位點平均有效等位基因數(shù)(e)為2.63—3.56, 數(shù)值最高的群體均為廣西北海群體; 香儂指數(shù)為1.12—1.39, 群體觀測雜合度為0.46—0.57, 其中北海群體最低, 寧海群體最高; 群體期望雜合度為0.58—0.64, 其中平潭群體最低, 儋州群體最高。整個中國鱟物種水平上, 平均每位點等位基因數(shù)為11.57, 平均每個位點有效等位基因數(shù)為3.49, 香儂指數(shù)為1.39, 觀測雜合度為0.49, 期望雜合度為0.62。總體上, 中國鱟種群多態(tài)性水平較高(表3)。

表2 9個多態(tài)性微衛(wèi)星位點特征

Tab.2 Characteristics of nine polymorphic microsatellite loci

注： *為不存在啞等位基因的位點; NS指偏離Hardy-Weinberg平衡(HWE)不顯著(>0.05)

表3 中國鱟9個群體遺傳多樣性特征

Tab.3 Polymorphic characteristics of nine groups of T. tridentatus

注： 表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差

2.4 中國東南沿海中國鱟群體間遺傳分化分析

對中國大陸沿海9個中國鱟地方群體間的遺傳差異進行(AMOVA)分析表明(表4), 100.23%的變異來自群體內(nèi), 而群體間的遺傳變異為–0.23%。因此, 遺傳變異絕大部分來自群體內(nèi), 群體間遺傳差異極小。9個多態(tài)性微衛(wèi)星標記分析結(jié)果表明中國東南沿海中國鱟群體間無遺傳差異。

中國鱟9個地方群體間遺傳分化系數(shù)st介于–0.04084—0.02615之間,值顯著性檢驗結(jié)果顯示, 9個群體兩兩比較, 均無顯著分化(>0.05)(表5), 支持以上AMOVA分析結(jié)果。群體間的基因流最小為13.907, 許多群體間基因流為無限交流狀態(tài)(表5)。最遠的地理距離為寧海與北海之間, 達1767km, 它們之間未見顯著分化, 且有著較高的基因流(129.61)。

表4 中國東南沿海中國鱟9個群體間遺傳變異的分子變異等級分析(AMOVA)

Tab.4 AMOVA analysis of genetic variation among nine populations of T. tridentatus in Chinese sea waters

表5 中國鱟各地理種群之間遺傳分化系數(shù)(st)(對角線以下)和基因流(m)(對角線以上)

Tab.5 Genetic difference (Fst) (below diagonal) and gene flow (Nm) (above diagonal) among nine populations of T. tridentatus

注： inf指無限交流狀態(tài)

利用Structure 2.2對中國鱟種群進行基于個體歸類的聚類分析。運行MCMC計算方法確定合適的值(聚類分群數(shù)), 結(jié)果表明從1到10對應(yīng)的ln()(即ln(D)值)從為2開始都是平緩的曲線, 因此為2對中國鱟分群是合適的(圖2)。

貝葉斯基因型聚類分析(=2)結(jié)果表明, 9個中國鱟地理群體的個體較均勻分布于2個基因型類群(圖3), 未見任何一個個體獨立分配于一個類群當中, 各采樣點的個體分群圖形相似, 無顯著分化的地理群體, 當=3時, 同樣未見分化的類群(圖4)。

圖2 中國鱟多位點基因型聚類簇K從1到10對應(yīng)的平均lnP(D)值

圖3 9個中國鱟采樣點貝葉斯基因型聚類分析(K=2)

圖4 9個中國鱟采樣點貝葉斯基因型聚類分析(K=3)

2.5 群體間遺傳距離分析

群體間Nei遺傳相似度和遺傳距離分析結(jié)果表明(表6), 9個地理群體中, 地理位置相隔最近、同屬于北部灣海域的北海與儋州群體間遺傳相似度最大(0.9748), 遺傳距離最小(0.0256), 說明這2個群體間親緣關(guān)系最近; 而地理間隔最大的寧海與北海群體之間遺傳相似度最小(0.9132), 遺傳距離最大(0.0907)。

然而, 中國東南沿海中國鱟9個地方群體遺傳距離與地理距離之間的相關(guān)性經(jīng)Mantel分析結(jié)果表明, 遺傳距離與地理距離之間無相關(guān)性(=0.462), 未見因地理距離而分化的群體(見圖5)。

表6 中國鱟9個群體間Nei遺傳相似度(對角線以上)和遺傳距離(對角線以下)

Tab.6 Nei’s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of nine populations of T. tridentatus

圖5 地理距離與Fst的相關(guān)性

3 討論

3.1 中國鱟微衛(wèi)星多態(tài)性特點

本研究采用FIASCO方法建立中國鱟微衛(wèi)星DNA富集文庫, 并從文庫中篩選獲得60條含有微衛(wèi)星的DNA序列, 其中38條可設(shè)計引物, 但有12對引物無擴增產(chǎn)物, 可能原因是微衛(wèi)星側(cè)翼序列(設(shè)計引物的位點)發(fā)生突變而無法擴增。而有擴增產(chǎn)物的26個位點中, 其中有17個座位無多態(tài)性, 占65.4%, 單態(tài)位點比例較高。

獲得的9個多態(tài)性SSR位點中除了WTT1和WTT8兩個位點外, 其余7個位點均偏離Hardy-Weinberg平衡, 且存在啞等位基因, 固定指數(shù)顯示雜合體缺失。啞等位基因的存在和雜合體缺失可能是引起這些位點偏離Hardy-Weinberg平衡的主要原因。雜合體缺失的原因可能是中國鱟存在非隨機交配現(xiàn)象, 或群體過小等引起。目前調(diào)查表明, 中國鱟資源急劇下降, 鱟數(shù)量已經(jīng)極少, 因此存在近親繁殖的可能, 瓶頸效應(yīng)不可避免。King等(2004)篩選美洲鱟的微衛(wèi)星標記, 22個座位平均等位基因數(shù)為13.9, 高于本研究從中國鱟上獲得9個座位的平均等位基因數(shù)(8.11)。美洲鱟資源遠較中國鱟豐富, 從這些位點高多態(tài)性特點上也反映了美洲鱟具有較高的遺傳多態(tài)性; 但美洲鱟22個位點中仍有5個位點偏離Hardy-Weinberg平衡。美洲鱟和中國鱟微衛(wèi)星座位偏離Hardy-Weinberg平衡有待于進一步分析原因。

3.2 微衛(wèi)星篩選的策略

自從Tautz等(1984)報道了從多種生物上獲得多種類型的微衛(wèi)星序列以來, 微衛(wèi)星標記已成為目前用途廣泛的遺傳標記之一, 在遺傳圖譜構(gòu)建、親子鑒定、種群遺傳學(xué)和保護生物學(xué)等方面得到廣泛的應(yīng)用(Zhao, 2019)。本文采用FIASCO法富集SSR基因, 步驟簡單、成本低, 磁珠-探針-DNA復(fù)合物經(jīng)過多次洗脫, 可去除非特異性序列, 可大大提高篩選效率, 因而能夠高效地從基因組中分離微衛(wèi)星序列。

隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展, 通過測序方法來篩選微衛(wèi)星標記已變得越來越容易, 且成本低, 這也促進微衛(wèi)星標記的廣泛應(yīng)用。例如, 岳華梅等(2016)對興國紅鯉生殖相關(guān)組織進行轉(zhuǎn)錄組測序, 從中篩選獲得大量多態(tài)性微衛(wèi)星位點。Cai等(2015)則從中國鱟血細胞構(gòu)建的RNA文庫獲得的轉(zhuǎn)錄組中挖掘出12個微衛(wèi)星標記, 同樣可應(yīng)用于中國鱟群體遺傳多樣性分析。

3.3 中國海域中國鱟的遺傳多樣性

中國鱟在中國海域的歷史分布最北為長江口南部, 南到北部灣。本研究9個采樣點覆蓋了中國鱟在我國東南沿海的現(xiàn)有分布區(qū)。將中國海域的中國鱟作為整體分析的結(jié)果顯示, 7個位點平均等位基因數(shù)為11.57, 平均有效等位基因數(shù)為3.5, 期望雜合度為0.62, 香儂指數(shù)為1.39, 多態(tài)性信息含量為0.58。說明整個種群遺傳多樣性仍較高。Schultz等(2009)認為PIC>0.5為高多態(tài)性信息含量, 0.5>PIC>0.25的信息含量為中等適度, 而PIC<0.25為低信息含量。中國鱟7個位點中, 除了位點WTT9(PIC<0.25)為低信息含量的位點外, 其他微衛(wèi)星座位的多態(tài)性信息含量(PIC)值都較高, 可為中國鱟遺傳多樣性分析提供高效的標記。這些多樣性指標表明分布中國東南沿海的中國鱟種群的遺傳多樣性仍較高。

中國海域中國鱟遺傳多樣性高的原因可能源于歷史上中國鱟曾經(jīng)在中國東南沿海大量分布、種群資源豐富、個體數(shù)量多、基因庫豐富的緣故。根據(jù)調(diào)查, 30年前, 中國海域的中國鱟還是相當豐富的, 有些海灘夏季上岸產(chǎn)卵的親鱟數(shù)量還是相當可觀的。但隨著中國海域中國鱟資源量的衰竭, 中國鱟的遺傳多樣性下降將成為必然, 所以必須要采取有效措施對鱟資源進行保護管理。

3.4 中國海域中國鱟種群遺傳結(jié)構(gòu)特點

中國鱟9個地方群體間遺傳分化系數(shù)st兩兩比較顯著性檢驗結(jié)果表明, 均無顯著分化(>0.05)。群體間的基因流為13.9以上, 表明中國東南沿海的中國鱟不同地理群體間基因交流頻繁, 屬于同一個遺傳群體。AMOVA分析結(jié)果顯示遺傳變異主要來自群體內(nèi), 群體間變異極小, 同樣表明中國海域中國鱟簡單的遺傳結(jié)構(gòu), 無分化的亞居群。而且地理距離與遺傳距離無相關(guān)性。

中國鱟在中國東南沿海的分布區(qū)從浙江寧海到北部灣綿延1700km以上, 路程涵蓋了東海、南海, 繞過雷州半島, 直至北部灣, 但是群體間遺傳分化系數(shù)st顯著性檢驗表明不同地理群體間無群體遺傳分化, 同屬一個繁殖群體, 不同地方群體間存在強烈的基因交流。寧海與北部灣相隔1700km遠, 這2個地理群體間存在基因交流, 是否因為中國鱟確實能進行長達1700km的遷移？中國鱟是底棲物種, 幼鱟孵化和成長于潮間帶, 而成鱟主要蟄居于淺海。從其生態(tài)特點分析, 似乎其游泳遷移能力不是很強, 1700km長距離遷移可能性不大, 那么或是近海海流的運動在鱟的遷移中起推動作用？Antoro等(2006)在分析斜帶石斑魚()時, 同樣發(fā)現(xiàn)相距1144km的群體間無遺傳分化, 而相距638km的2個群體間卻有顯著分化, Antoro等提出海流在其中起重要的作用。而海流對鱟遺傳分化影響有待于進一步分析研究。

分布于中國東南沿海的中國鱟沒有遺傳分化的原因, 可能主要還是人為的遷移引起的。其一, 鱟做為海鮮美食而在全國各地走私販賣, 人為運輸嚴重。中國東南沿海特別是浙江省、福建省和廣東省的民眾喜歡食用鱟, 鱟作為海鮮食品的需求量極大, 因而中國鱟遭遇過度捕殺, 這也是鱟資源量劇減的一個重要原因。根據(jù)我們調(diào)查, 因目前北部灣的鱟資源量相對較多, 從北部灣走私到浙江省和福建省以及內(nèi)陸各地的情況很嚴重, 而且一些人口稍少、鱟還尚存的海島, 如本研究的采樣點浙江洞頭島、福建湄洲島以及漳浦, 都在向全國各地走私鱟。鱟具較強耐低氧能力方便長途運輸。其二, 無序的人工放生活動促進地方群體間的基因交流。在20世紀80—90年代, 中國鱟就已被列入沿海各省省級重點保護動物名錄, 執(zhí)法部門經(jīng)常收繳市場上販賣的中國鱟, 然后就地放流, 一次放流量可達數(shù)百只鱟。我們調(diào)查還發(fā)現(xiàn), 不少地方的宗教組織常年采購鱟, 然后進行放生活動。因此中國東南沿海中國鱟各地理群體間無遺傳分化的原因是人為運輸引起的。

3.5 中國鱟的保護管理建議

本研究結(jié)果表明中國海域的中國鱟未有顯著遺傳分化, 各產(chǎn)地原產(chǎn)種群已出現(xiàn)混雜, 未能分辨出進化顯著單元。鑒于北部灣較其他海域存在較多中國鱟的狀況, 可考慮遷地保護, 將北部灣鱟引入福建省、浙江省海域進行種群擴大, 將不會產(chǎn)生負面的遺傳效應(yīng), 而且有利于中國鱟資源的恢復(fù)。特別是經(jīng)濟發(fā)達的浙江省海域, 鱟資源已極度匱乏, 非常有必要進行中國鱟的引入和種群復(fù)壯。

4 結(jié)論

中國鱟為珍稀物種, 其資源保護亟待保護, 其種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性信息是制定中國鱟保護和管理策略的基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明: 分布中國東南沿海的中國鱟種群多態(tài)性水平仍較高, 但目前中國大陸沿海中國鱟地方群體間無顯著遺傳分化, 存在較高的基因流。推測人為的遷移是造成遺傳無分化的主要原因。鑒于不少海域中國鱟資源已匱乏, 可從其他地方引入, 進行種群復(fù)壯。

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ISOLATION OF MICROSATELLITE MARKERS INAND ANALYSIS OF THEIR GENETIC POLYMORPHISM AND GENETIC STRUCTURE

WENG Zhao-Hong, XIE Yang-Jie, XIAO Zhi-Qun, WANG Zhi-Yong

(Fisheries College, Jimei University, Key Laboratory of Healthy Mariculture for the East China Sea, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Xiamen 361021, China)

Microsatellite-enriched libraries of (CA)in Chinese horseshoe crab () were constructed using FIASCO (Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing repeats) method, from which 214 positive clones were selected to sequence. After screening, 60 sequences containing microsatellite loci were obtained, in which 38 sequences could be used to design primers. Thirty eight pairs of primers were used to PCR in 37 horseshoe crabs. Results show that only nine microsatellite loci were polymorphism with the allele number ranging from 5 to 14, in average of 8.1. There was no genetic linkage between the nine loci. The genetic diversity and structure were analyzed using these polymorphic microsatellite markers. The results indicate that the polymorphism of the nine Chinese horseshoe crab populations along the southeast coast of China remained high, and there was no genetic difference among nice local populations of Chinese horseshoe crab. Therefore, no significant differentiation was found in high gene flow among the populations. It was speculated that human migration was the main cause of non-genetic differentiation. To restore the local population resources, the horseshoe crabs should be introduced to those sea areas where the horseshoe crab has been extinct.

Chinese horseshoe crab; microsatellite markers; FIASCO; genetic polymorphism; genetic structure

* 國家水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺項目, 2019DKA30470號。翁朝紅, 博士, 教授, E-mail: wengzhaohong@jmu.edu.cn

謝仰杰, 博士, 教授, E-mail: yjxie@jmu.edu.cn

2019-11-06,

2020-01-19

Q958.2

10.11693/hyhz20191100204