李宇 王偉 邱裕佳

1.葫蘆島市中心醫(yī)院，遼寧 葫蘆島 125000 2.錦州醫(yī)科大學(xué)骨外科學(xué)研究所，遼寧 錦州 121000 3.遼寧省醫(yī)學(xué)組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 錦州 121000 4.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱骨質(zhì)增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎等，是一種進(jìn)行性慢性發(fā)展的骨關(guān)節(jié)疾病[1]，以膝關(guān)節(jié)發(fā)病為多見，關(guān)節(jié)軟骨受損是此疾病的重中之重，而軟骨細(xì)胞的增殖與凋亡對(duì)受損軟骨的修復(fù)起著至關(guān)重要的作用。骨性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛，有時(shí)伴有關(guān)節(jié)畸形，功能受限，此病已嚴(yán)重影響了中老年人的正常生活，給社會(huì)及家庭帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。

中醫(yī)學(xué)中認(rèn)為，此疾屬于“骨痹”“筋痹”等范疇，所謂骨痹主要分為風(fēng)寒濕癥、肝腎虧虛、濕熱蘊(yùn)結(jié)、痰濕血瘀、當(dāng)風(fēng)寒濕邪入體，陰陽(yáng)及臟腑失衡，血行不暢而瘀阻，加之肝腎之氣不足，而致筋骨不利。補(bǔ)腎壯筋湯首載于清·錢秀昌所著的《傷科補(bǔ)要》，此方具有補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、活血化瘀的功效，應(yīng)用于膝OA的治療中效果顯著[3]。

鹽酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate，GS)在軟骨基質(zhì)中分布較廣泛，屬于一種小分子化合物，不僅能夠有效促進(jìn)軟骨蛋白聚糖的生成，而且也能有效控制炎細(xì)胞和介質(zhì)的擴(kuò)散[4]，降低軟骨細(xì)胞內(nèi)毒性，臨床應(yīng)用中已成為0到II級(jí)膝骨性關(guān)節(jié)炎的常規(guī)用藥，其治療效果在臨床上已得到公認(rèn)[5]。

本實(shí)驗(yàn)選用了中醫(yī)經(jīng)典方劑補(bǔ)腎壯筋湯與鹽酸氨基葡萄糖聯(lián)合應(yīng)用，制備含藥血清，對(duì)大鼠膝軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡及II型膠原蛋白表達(dá)方面進(jìn)行檢測(cè)，為膝骨性關(guān)節(jié)炎的中西醫(yī)結(jié)合治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究選用未交配的SPF級(jí)大鼠32只，雌雄不拘，體重為(200±20) g(錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明號(hào)：211001200000172)，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，并隨機(jī)分為單純血清組(生理鹽水)、中藥血清組(補(bǔ)腎壯筋湯)、西藥血清組(鹽酸氨基葡萄糖)、中西結(jié)合血清組(補(bǔ)腎壯筋湯聯(lián)合鹽酸氨基葡萄糖)4組，每組8只。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物與制備：按照大鼠每日用藥量為人每千克每日用藥量的6.3倍，按大鼠胃容量為容積為每100 g 0.875 mL灌胃給藥。

補(bǔ)腎壯筋湯灌胃湯劑制備：熟地黃0.012 mg，當(dāng)歸0.012 mg，牛膝0.010 mg，山茱萸0.012 mg，茯苓0.012 mg，續(xù)斷0.012 mg，杜仲0.010 mg，白芍0.010 mg，青皮0.005 mg，五加皮0.010 mg，以上藥物均采購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。水煎濃縮，用蒸餾水調(diào)節(jié)藥物濃度至100%，制成每毫升含生藥1 g。根據(jù)動(dòng)物與人體每千克體重劑量折算公式計(jì)算每只大鼠的給藥劑量為7.52 mg/g。

鹽酸氨基葡萄糖(北京葡立藥業(yè)有限公司，批號(hào)：H20173212)灌胃劑制備：大鼠每日灌胃劑量為0.375 mg。

正常對(duì)照組灌胃劑制備：用等量0.9%氯化鈉注射液(華仁藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H20023145)。

1.1.3主要試劑：硝普鈉(購(gòu)自Sigma公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自DoJinDO公司)，MTT(購(gòu)自索萊寶公司)，胎牛血清(購(gòu)自SeraPro公司)，青鏈霉素、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液、購(gòu)自HyClone公司)，阿爾新藍(lán)染色試劑盒(購(gòu)自Sigma公司)，兔抗II型膠原蛋白多克隆抗體(購(gòu)自Abcam公司)，SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白提取試劑盒、定量試劑盒(均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.4主要儀器：倒置顯微鏡(Olympus公司公司)；熒光顯微鏡(Leica公司)；紫外分光光度計(jì)(Tecan公司)；全自動(dòng)電泳儀(Bio-Rad公司)；流式細(xì)胞檢測(cè)儀(BD公司)；CO2細(xì)胞孵育箱(Thermo Fisher公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)：將大鼠斷頸處死，用PBS反復(fù)沖洗剪下的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨，制備成1 mm3的碎塊，在37 ℃條件下，用胰蛋白酶(0.25%)消化30 min，再用Ⅱ型膠原蛋白酶(0.1%)消化60 min，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞。加入含胎牛血清DMEM培養(yǎng)液(10%)中，以合適的濃度(1×106個(gè)/mL)接種于培養(yǎng)皿中，在CO2細(xì)胞孵育箱培養(yǎng)；48 h觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)狀態(tài)，每2～3 d換液1次，當(dāng)鏡下觀察軟骨細(xì)胞匯合成片長(zhǎng)滿大部分培養(yǎng)皿時(shí)，加入胰蛋白酶(0.25%)進(jìn)行傳代養(yǎng)。細(xì)胞傳代至第4代時(shí)，方達(dá)到本實(shí)驗(yàn)研究的要求，用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2.2含藥血清制備：各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，藥物灌胃1周，取材前禁食水，于第8天早灌胃2 h后，先用10%水合氯醛按大鼠體重每百克0.3 mL腹腔注射進(jìn)行麻醉，采用腹主動(dòng)脈取血法收取血液，4 ℃低溫保存4 h后，以3 000 r/min的速度離心30 min，取上清，用0.22 μm濾膜除菌分裝，-80 ℃保存待用。

1.2.3軟骨細(xì)胞阿爾新藍(lán)染色：按阿爾新藍(lán)染色試劑盒配置液體，染色方法：棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，5 min/次，4%多聚甲醛固定30 min(室溫)，PBS漂洗3次，0.1 N HCL溶液浸洗5 min時(shí)PH值降至1.0，阿爾新藍(lán)染色過(guò)夜，0.1 N HCL漂洗3次，5 min/次，去除背景，鏡下觀察。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力：計(jì)數(shù)以5×104個(gè)/mL濃度的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結(jié)合血清組，除空白對(duì)照組以外其余各組予以相應(yīng)含0.6%、1.2%、2.4%含藥血清的培養(yǎng)基處理。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μL DMSO。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm處檢測(cè)各孔的吸光度值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：制備大鼠軟骨細(xì)胞懸液(1×106個(gè)/mL)接種于培養(yǎng)皿中，在5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃預(yù)培養(yǎng)24 h。加入終濃度為2 mmol/L的SNP作用24 h制作軟骨細(xì)胞凋亡模型。將凋亡軟骨細(xì)胞分為單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結(jié)合血清組，分別予以相應(yīng)含1.2%含藥血清的培養(yǎng)基處理72 h。用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗2～3次，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL。參照凋亡試劑盒的步驟說(shuō)明，分別加入Annexin V-FITC(5 μL)、PI(5 μL)，4 ℃避光染色15 min，上機(jī)分析。

1.2.6Western blot法檢測(cè)II型膠原蛋白的表達(dá)：收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞，加入裂解液裂解細(xì)胞提取蛋白。將各組蛋白按照BCA法調(diào)整至相同濃度。每上樣孔加入等量蛋白，10%的SDS-PAGE膠分離電泳。半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃過(guò)夜，次日，TBST洗膜，再加入二抗室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光試劑顯像，掃描條帶并采集圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 原代軟骨細(xì)胞提取及阿爾新藍(lán)染色鑒定

在倒置顯微鏡下觀察體外分離培養(yǎng)大鼠的原代軟骨細(xì)胞，細(xì)胞大體呈圓球形，懸浮狀態(tài)，約12 h后開始貼壁，1～2 d后部分細(xì)胞貼壁伸展，呈三角形、多角形。部分細(xì)胞出現(xiàn)分裂相，3～5 d大部分細(xì)胞貼壁較完全，增殖分裂加快。傳代至4代時(shí)，可以觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞周邊可見具有較明顯折光性的細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞呈片狀生長(zhǎng)，可呈明顯的“鋪路石”狀外觀。按照阿爾新藍(lán)染色試劑盒步驟進(jìn)行染色后，倒置顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞多呈多角形，胞質(zhì)呈均質(zhì)狀，較疏松，大部分可見到核仁，少數(shù)也可見分裂相，細(xì)胞漿和胞膜呈藍(lán)色，證明培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞合成和分泌蛋白聚糖(見圖1)。

圖1 軟骨細(xì)胞阿爾新藍(lán)染色 A：放大倍數(shù)×100；B：放大倍數(shù)×200。Fig.1 Alcian blue staining of chondrocytes. A: × 100; B: × 200.

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力

采用MTT法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)各組的OD值，以明確中藥、西藥及其聯(lián)合治療在不同血清濃度下，對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響。雙因素方差分析結(jié)果顯示，與單純血清組、中藥血清組、西藥血清組比較，中西結(jié)合血清組OD值明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.76，P<0.01)；不同血清濃度比較，血清濃度為1.2%時(shí)對(duì)細(xì)胞活性的促進(jìn)作用最為顯著(F=13.69，P<0.01)；組間兩兩比較顯示，中西結(jié)合含藥血清濃度為1.2%時(shí)，細(xì)胞OD值明顯高于其他各治療組(見圖2)。此結(jié)果說(shuō)明中西結(jié)合含藥血清組促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖明顯優(yōu)于單純血清組、中藥及西藥組，但不隨含藥血清濃度的增加呈正比例遞增，當(dāng)中西結(jié)合含藥血清濃度為1.2%時(shí)，對(duì)軟骨細(xì)胞的增殖作用最為顯著。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.3 Flow cytometry to detect apoptosis

圖2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力Fig.2 MTT assay for cell proliferation

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結(jié)合血清組細(xì)胞凋亡率分別為(91.58±0.87)%、(81.68±1.09)%、(12.32±0.44)%、(1.54±0.87)%；各組間比較存在明顯差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=119.80，P<0.01)，其中中西醫(yī)結(jié)合血清組降低軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于單純血清組、中藥血清組及西藥血清組。此結(jié)果說(shuō)明中西醫(yī)結(jié)合組能夠明顯降低軟骨細(xì)胞的凋亡，對(duì)軟骨細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用(見圖3)。

2.4 Western blot檢測(cè)II型膠原蛋白的表達(dá)

采用Western blot檢測(cè)上述4組中II型膠原蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，各組比較均存在差異且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=407.5，P<0.01)，其中中西醫(yī)結(jié)合血清組二型膠原蛋白的表達(dá)(灰度值=1.33±0.037)均明顯高于中藥血清組、西藥血清組及單純血清組(灰度值=0.99±0.019、1.11±0.026、0.61±0.017)。此結(jié)果說(shuō)明，中西醫(yī)結(jié)合血清組能夠明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞中II型膠原蛋白的表達(dá)(見圖4)。

圖4 Western blot檢測(cè)II型膠原蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of collagen type II detected with Western blotting

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎的核心是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變，伴周圍骨質(zhì)增生的一種慢性進(jìn)行性發(fā)展的疾病[6]。軟骨細(xì)胞數(shù)量的減少或大量凋亡無(wú)疑會(huì)加速疾病的進(jìn)程。因此，促軟骨細(xì)胞增殖[7]及降低軟骨細(xì)胞凋亡率[8]，是防治以及治療骨性關(guān)節(jié)炎的有效途徑之一。

補(bǔ)腎壯筋湯傳承于《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》中的精辟，清·錢秀昌結(jié)合自己的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)于1808年所著《傷科補(bǔ)要》記載[9]，此方中各味藥相輔相成，熟地黃、山茱萸為君藥，具有填精益髓、肝腎同補(bǔ)的作用；續(xù)斷、杜仲、五加皮為臣藥，增進(jìn)補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、祛風(fēng)除濕的作用；當(dāng)歸補(bǔ)血活血，白芍?jǐn)筷幒蜖I(yíng)、柔肝止痛，茯苓健脾和胃、化痰除濕，青皮行氣疏肝，同為佐藥；牛膝補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨、活血通經(jīng)，引火(血)下行，使方中諸藥直達(dá)病癥為使藥[10]。諸藥合用可以達(dá)到補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋壯骨的功效。而膝關(guān)節(jié)軟骨損傷在祖國(guó)醫(yī)學(xué)古籍中并無(wú)明確記載，但從此疾的病因及癥狀等應(yīng)歸屬于痹癥、膝痹、骨痹、痿證等范疇[11]。肝主筋，腎主骨，肝腎同源，筋約束骨骼構(gòu)成關(guān)節(jié)而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)，筋骨是由肝腎的精氣和氣血來(lái)充養(yǎng)的。當(dāng)肝血不足、腎元虧虛時(shí)骨骼也會(huì)發(fā)生異常的改變，氣血不足，導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)瘀滯，不通則痛，而補(bǔ)腎壯筋湯不僅可以加速局部的血液循環(huán)，其強(qiáng)筋壯骨的功效可以使關(guān)節(jié)退變或損傷的軟骨得到改善及修復(fù)，從而達(dá)到改善和防治OA病情發(fā)展的目的[12]。

既往研究中，研究者認(rèn)為補(bǔ)腎壯筋湯能夠有效抑制OA的軟骨發(fā)生退行性改變，通過(guò)抑制軟骨基質(zhì)中的纖維變性，降低炎癥細(xì)胞和蛋白多糖的含量，增加透明質(zhì)酸的含量；同時(shí)也是天然產(chǎn)物化合物的特殊子集，因此能夠提高細(xì)胞抗氧化酶的活動(dòng)，避免自由基對(duì)軟骨細(xì)胞的病理性損害，從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞的自我增殖與修復(fù)[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，中藥組對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的增殖作用明顯高于單純血清組，對(duì)軟骨細(xì)胞中II型膠原蛋白的表達(dá)也明顯高于單純血清組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

鹽酸氨基葡萄糖是一種小分子氨基多糖，是軟骨基質(zhì)糖胺聚糖的主要構(gòu)成成分，在已受損軟骨的修復(fù)過(guò)程中有著極其重要的作用[14]，當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨因退變或損傷出現(xiàn)裂縫時(shí)，可引起肉芽組織增生，軟骨基質(zhì)水解破壞，蛋白多糖的含量也因此而減少[15]。氨基葡萄糖不僅能夠促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中膠原的合成，還具有抑制彈性蛋白酶、溶酶體酶等水解酶的釋放，促進(jìn)成纖維細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞的移動(dòng)，抑制炎癥因子或肉芽組織增生范圍繼續(xù)擴(kuò)大[16]。鹽酸氨基葡萄糖對(duì)蛋白多糖的合成有促進(jìn)作用，蛋白多糖是細(xì)胞膜和細(xì)胞間質(zhì)重要的構(gòu)成成分，能夠穩(wěn)定二者之間的連接[17]，給軟骨細(xì)胞的增長(zhǎng)提供穩(wěn)定環(huán)境，關(guān)節(jié)軟骨的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)得到改善，對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和保護(hù)起著重要的作用[18]。

當(dāng)骨性關(guān)節(jié)炎疾病中軟骨細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)[19]，SNP可產(chǎn)生外源性一氧化氮(nitrous oxide，NO)，NO是由于一氧化氮合酶作用于精氨酸產(chǎn)生的，參與機(jī)體多個(gè)系統(tǒng)的病理生理過(guò)程[20]。Maneiro等[21]將體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞與較高濃度的SNP溶液共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡，其機(jī)制與SNP產(chǎn)生NO有關(guān)[22]。在既往研究中，有研究者認(rèn)為NO在最常見的cGMP途徑中作用于GTP環(huán)化酶，與血紅素中的亞鐵離子結(jié)合，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，催化GTP產(chǎn)生cGMP的含量。同時(shí)，GTP增加后也促進(jìn)了影響細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因如bcl-2、P53等蛋白的合成[23]，從而影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展[24]。在本實(shí)驗(yàn)中，中西結(jié)合含藥血清組能夠明顯降低SNP(NO)誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型中軟骨細(xì)胞的凋亡率，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；可能與中西結(jié)合血清組能夠減少NO含量，抑制軟骨細(xì)胞凋亡的發(fā)生，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變，促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用有關(guān)。

將傳統(tǒng)經(jīng)方補(bǔ)腎壯筋湯與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物鹽酸氨基葡萄糖聯(lián)合，制備大鼠含藥血清通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，中西結(jié)合血清組與單純血清組、中藥血清組及西藥血清組方比較對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖具有明顯的優(yōu)勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞中II型膠原蛋白表達(dá)也明顯優(yōu)于其他各實(shí)驗(yàn)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明中西結(jié)合方式具有很好的協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成有關(guān)，降解導(dǎo)致細(xì)胞代謝失衡的相關(guān)因素，減輕炎癥因子對(duì)軟骨細(xì)胞的影響，為中西醫(yī)藥物聯(lián)合治療骨性關(guān)節(jié)炎提供有價(jià)值的綜合化治療方案。

近年來(lái)，研究者對(duì)中醫(yī)藥藥理作用上有了更深層次的認(rèn)知和了解，從病人的整體觀入手，辨證施治，中醫(yī)治病重在辨證與辨病相結(jié)合，更加適用于患者本身[25-26]。補(bǔ)腎壯筋湯作為骨傷疾病中的經(jīng)典方劑在治療腎虛腰痛、腰椎間盤突出癥、退行性骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等疾病中已取得了良好的效果[27-28]。聯(lián)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物鹽酸氨基葡萄糖的治療機(jī)理，必然能夠進(jìn)一步提高療效，為廣大患者服務(wù)，提高患者生活、工作質(zhì)量，減輕患者的疼痛，為延緩及治療骨性關(guān)節(jié)炎提供更為有效、安全的一種治療方式。