李宇 王偉 邱裕佳
1.葫蘆島市中心醫(yī)院,遼寧 葫蘆島 125000 2.錦州醫(yī)科大學(xué)骨外科學(xué)研究所,遼寧 錦州 121000 3.遼寧省醫(yī)學(xué)組織工程重點實驗室,遼寧 錦州 121000 4.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧 錦州 121000
骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)又稱骨質(zhì)增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎等,是一種進行性慢性發(fā)展的骨關(guān)節(jié)疾病[1],以膝關(guān)節(jié)發(fā)病為多見,關(guān)節(jié)軟骨受損是此疾病的重中之重,而軟骨細胞的增殖與凋亡對受損軟骨的修復(fù)起著至關(guān)重要的作用。骨性關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛,有時伴有關(guān)節(jié)畸形,功能受限,此病已嚴重影響了中老年人的正常生活,給社會及家庭帶來嚴重的經(jīng)濟負擔(dān)[2]。
中醫(yī)學(xué)中認為,此疾屬于“骨痹”“筋痹”等范疇,所謂骨痹主要分為風(fēng)寒濕癥、肝腎虧虛、濕熱蘊結(jié)、痰濕血瘀、當(dāng)風(fēng)寒濕邪入體,陰陽及臟腑失衡,血行不暢而瘀阻,加之肝腎之氣不足,而致筋骨不利。補腎壯筋湯首載于清·錢秀昌所著的《傷科補要》,此方具有補益肝腎、強筋壯骨、活血化瘀的功效,應(yīng)用于膝OA的治療中效果顯著[3]。
鹽酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate,GS)在軟骨基質(zhì)中分布較廣泛,屬于一種小分子化合物,不僅能夠有效促進軟骨蛋白聚糖的生成,而且也能有效控制炎細胞和介質(zhì)的擴散[4],降低軟骨細胞內(nèi)毒性,臨床應(yīng)用中已成為0到II級膝骨性關(guān)節(jié)炎的常規(guī)用藥,其治療效果在臨床上已得到公認[5]。
本實驗選用了中醫(yī)經(jīng)典方劑補腎壯筋湯與鹽酸氨基葡萄糖聯(lián)合應(yīng)用,制備含藥血清,對大鼠膝軟骨細胞的增殖、凋亡及II型膠原蛋白表達方面進行檢測,為膝骨性關(guān)節(jié)炎的中西醫(yī)結(jié)合治療提供新的理論依據(jù)。
1.1.1實驗動物:本研究選用未交配的SPF級大鼠32只,雌雄不拘,體重為(200±20) g(錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,實驗動物質(zhì)量合格證明號:211001200000172),進行適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,并隨機分為單純血清組(生理鹽水)、中藥血清組(補腎壯筋湯)、西藥血清組(鹽酸氨基葡萄糖)、中西結(jié)合血清組(補腎壯筋湯聯(lián)合鹽酸氨基葡萄糖)4組,每組8只。
1.1.2實驗藥物與制備:按照大鼠每日用藥量為人每千克每日用藥量的6.3倍,按大鼠胃容量為容積為每100 g 0.875 mL灌胃給藥。
補腎壯筋湯灌胃湯劑制備:熟地黃0.012 mg,當(dāng)歸0.012 mg,牛膝0.010 mg,山茱萸0.012 mg,茯苓0.012 mg,續(xù)斷0.012 mg,杜仲0.010 mg,白芍0.010 mg,青皮0.005 mg,五加皮0.010 mg,以上藥物均采購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。水煎濃縮,用蒸餾水調(diào)節(jié)藥物濃度至100%,制成每毫升含生藥1 g。根據(jù)動物與人體每千克體重劑量折算公式計算每只大鼠的給藥劑量為7.52 mg/g。
鹽酸氨基葡萄糖(北京葡立藥業(yè)有限公司,批號:H20173212)灌胃劑制備:大鼠每日灌胃劑量為0.375 mg。
正常對照組灌胃劑制備:用等量0.9%氯化鈉注射液(華仁藥業(yè)股份有限公司,批號:H20023145)。
1.1.3主要試劑:硝普鈉(購自Sigma公司),Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(購自DoJinDO公司),MTT(購自索萊寶公司),胎牛血清(購自SeraPro公司),青鏈霉素、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液、購自HyClone公司),阿爾新藍染色試劑盒(購自Sigma公司),兔抗II型膠原蛋白多克隆抗體(購自Abcam公司),SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白提取試劑盒、定量試劑盒(均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。
1.1.4主要儀器:倒置顯微鏡(Olympus公司公司);熒光顯微鏡(Leica公司);紫外分光光度計(Tecan公司);全自動電泳儀(Bio-Rad公司);流式細胞檢測儀(BD公司);CO2細胞孵育箱(Thermo Fisher公司);凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。
1.2.1大鼠軟骨細胞分離培養(yǎng):將大鼠斷頸處死,用PBS反復(fù)沖洗剪下的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨,制備成1 mm3的碎塊,在37 ℃條件下,用胰蛋白酶(0.25%)消化30 min,再用Ⅱ型膠原蛋白酶(0.1%)消化60 min,1 000 r/min離心10 min,收集細胞。加入含胎牛血清DMEM培養(yǎng)液(10%)中,以合適的濃度(1×106個/mL)接種于培養(yǎng)皿中,在CO2細胞孵育箱培養(yǎng);48 h觀察細胞貼壁及生長狀態(tài),每2~3 d換液1次,當(dāng)鏡下觀察軟骨細胞匯合成片長滿大部分培養(yǎng)皿時,加入胰蛋白酶(0.25%)進行傳代養(yǎng)。細胞傳代至第4代時,方達到本實驗研究的要求,用于本實驗。
1.2.2含藥血清制備:各組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,藥物灌胃1周,取材前禁食水,于第8天早灌胃2 h后,先用10%水合氯醛按大鼠體重每百克0.3 mL腹腔注射進行麻醉,采用腹主動脈取血法收取血液,4 ℃低溫保存4 h后,以3 000 r/min的速度離心30 min,取上清,用0.22 μm濾膜除菌分裝,-80 ℃保存待用。
1.2.3軟骨細胞阿爾新藍染色:按阿爾新藍染色試劑盒配置液體,染色方法:棄培養(yǎng)基,PBS漂洗3次,5 min/次,4%多聚甲醛固定30 min(室溫),PBS漂洗3次,0.1 N HCL溶液浸洗5 min時PH值降至1.0,阿爾新藍染色過夜,0.1 N HCL漂洗3次,5 min/次,去除背景,鏡下觀察。
1.2.4MTT法檢測細胞增殖活力:計數(shù)以5×104個/mL濃度的細胞懸液,接種于96孔培養(yǎng)板中。實驗分組:空白對照組、單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結(jié)合血清組,除空白對照組以外其余各組予以相應(yīng)含0.6%、1.2%、2.4%含藥血清的培養(yǎng)基處理。培養(yǎng)24 h后,每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL),于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去培養(yǎng)基,每孔加入200 μL DMSO。用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處檢測各孔的吸光度值。
1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡:制備大鼠軟骨細胞懸液(1×106個/mL)接種于培養(yǎng)皿中,在5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃預(yù)培養(yǎng)24 h。加入終濃度為2 mmol/L的SNP作用24 h制作軟骨細胞凋亡模型。將凋亡軟骨細胞分為單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結(jié)合血清組,分別予以相應(yīng)含1.2%含藥血清的培養(yǎng)基處理72 h。用胰蛋白酶消化并收集細胞,PBS洗2~3次,將細胞濃度調(diào)整為1×106個/mL。參照凋亡試劑盒的步驟說明,分別加入Annexin V-FITC(5 μL)、PI(5 μL),4 ℃避光染色15 min,上機分析。
1.2.6Western blot法檢測II型膠原蛋白的表達:收集實驗各組細胞,加入裂解液裂解細胞提取蛋白。將各組蛋白按照BCA法調(diào)整至相同濃度。每上樣孔加入等量蛋白,10%的SDS-PAGE膠分離電泳。半干法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃過夜,次日,TBST洗膜,再加入二抗室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光試劑顯像,掃描條帶并采集圖像分析。
在倒置顯微鏡下觀察體外分離培養(yǎng)大鼠的原代軟骨細胞,細胞大體呈圓球形,懸浮狀態(tài),約12 h后開始貼壁,1~2 d后部分細胞貼壁伸展,呈三角形、多角形。部分細胞出現(xiàn)分裂相,3~5 d大部分細胞貼壁較完全,增殖分裂加快。傳代至4代時,可以觀察到細胞生長速度加快,細胞周邊可見具有較明顯折光性的細胞外基質(zhì),細胞呈片狀生長,可呈明顯的“鋪路石”狀外觀。按照阿爾新藍染色試劑盒步驟進行染色后,倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞多呈多角形,胞質(zhì)呈均質(zhì)狀,較疏松,大部分可見到核仁,少數(shù)也可見分裂相,細胞漿和胞膜呈藍色,證明培養(yǎng)的軟骨細胞合成和分泌蛋白聚糖(見圖1)。
圖1 軟骨細胞阿爾新藍染色 A:放大倍數(shù)×100;B:放大倍數(shù)×200。Fig.1 Alcian blue staining of chondrocytes. A: × 100; B: × 200.
采用MTT法檢測實驗各組的OD值,以明確中藥、西藥及其聯(lián)合治療在不同血清濃度下,對細胞增殖活力的影響。雙因素方差分析結(jié)果顯示,與單純血清組、中藥血清組、西藥血清組比較,中西結(jié)合血清組OD值明顯增高,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.76,P<0.01);不同血清濃度比較,血清濃度為1.2%時對細胞活性的促進作用最為顯著(F=13.69,P<0.01);組間兩兩比較顯示,中西結(jié)合含藥血清濃度為1.2%時,細胞OD值明顯高于其他各治療組(見圖2)。此結(jié)果說明中西結(jié)合含藥血清組促進軟骨細胞增殖明顯優(yōu)于單純血清組、中藥及西藥組,但不隨含藥血清濃度的增加呈正比例遞增,當(dāng)中西結(jié)合含藥血清濃度為1.2%時,對軟骨細胞的增殖作用最為顯著。
圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡Fig.3 Flow cytometry to detect apoptosis
圖2 MTT法檢測細胞增殖活力Fig.2 MTT assay for cell proliferation
采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結(jié)果顯示,單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結(jié)合血清組細胞凋亡率分別為(91.58±0.87)%、(81.68±1.09)%、(12.32±0.44)%、(1.54±0.87)%;各組間比較存在明顯差異且具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=119.80,P<0.01),其中中西醫(yī)結(jié)合血清組降低軟骨細胞凋亡率明顯低于單純血清組、中藥血清組及西藥血清組。此結(jié)果說明中西醫(yī)結(jié)合組能夠明顯降低軟骨細胞的凋亡,對軟骨細胞有明顯的保護作用(見圖3)。
采用Western blot檢測上述4組中II型膠原蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,各組比較均存在差異且具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=407.5,P<0.01),其中中西醫(yī)結(jié)合血清組二型膠原蛋白的表達(灰度值=1.33±0.037)均明顯高于中藥血清組、西藥血清組及單純血清組(灰度值=0.99±0.019、1.11±0.026、0.61±0.017)。此結(jié)果說明,中西醫(yī)結(jié)合血清組能夠明顯促進軟骨細胞中II型膠原蛋白的表達(見圖4)。
圖4 Western blot檢測II型膠原蛋白的表達Fig.4 Expression of collagen type II detected with Western blotting
骨性關(guān)節(jié)炎的核心是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變,伴周圍骨質(zhì)增生的一種慢性進行性發(fā)展的疾病[6]。軟骨細胞數(shù)量的減少或大量凋亡無疑會加速疾病的進程。因此,促軟骨細胞增殖[7]及降低軟骨細胞凋亡率[8],是防治以及治療骨性關(guān)節(jié)炎的有效途徑之一。
補腎壯筋湯傳承于《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》中的精辟,清·錢秀昌結(jié)合自己的實踐經(jīng)驗于1808年所著《傷科補要》記載[9],此方中各味藥相輔相成,熟地黃、山茱萸為君藥,具有填精益髓、肝腎同補的作用;續(xù)斷、杜仲、五加皮為臣藥,增進補益肝腎、強筋壯骨、祛風(fēng)除濕的作用;當(dāng)歸補血活血,白芍斂陰和營、柔肝止痛,茯苓健脾和胃、化痰除濕,青皮行氣疏肝,同為佐藥;牛膝補益肝腎、強筋壯骨、活血通經(jīng),引火(血)下行,使方中諸藥直達病癥為使藥[10]。諸藥合用可以達到補益肝腎、強筋壯骨的功效。而膝關(guān)節(jié)軟骨損傷在祖國醫(yī)學(xué)古籍中并無明確記載,但從此疾的病因及癥狀等應(yīng)歸屬于痹癥、膝痹、骨痹、痿證等范疇[11]。肝主筋,腎主骨,肝腎同源,筋約束骨骼構(gòu)成關(guān)節(jié)而產(chǎn)生運動,筋骨是由肝腎的精氣和氣血來充養(yǎng)的。當(dāng)肝血不足、腎元虧虛時骨骼也會發(fā)生異常的改變,氣血不足,導(dǎo)致經(jīng)絡(luò)瘀滯,不通則痛,而補腎壯筋湯不僅可以加速局部的血液循環(huán),其強筋壯骨的功效可以使關(guān)節(jié)退變或損傷的軟骨得到改善及修復(fù),從而達到改善和防治OA病情發(fā)展的目的[12]。
既往研究中,研究者認為補腎壯筋湯能夠有效抑制OA的軟骨發(fā)生退行性改變,通過抑制軟骨基質(zhì)中的纖維變性,降低炎癥細胞和蛋白多糖的含量,增加透明質(zhì)酸的含量;同時也是天然產(chǎn)物化合物的特殊子集,因此能夠提高細胞抗氧化酶的活動,避免自由基對軟骨細胞的病理性損害,從而促進軟骨細胞的自我增殖與修復(fù)[13]。在本實驗中,中藥組對軟骨細胞增殖的增殖作用明顯高于單純血清組,對軟骨細胞中II型膠原蛋白的表達也明顯高于單純血清組,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
鹽酸氨基葡萄糖是一種小分子氨基多糖,是軟骨基質(zhì)糖胺聚糖的主要構(gòu)成成分,在已受損軟骨的修復(fù)過程中有著極其重要的作用[14],當(dāng)關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨因退變或損傷出現(xiàn)裂縫時,可引起肉芽組織增生,軟骨基質(zhì)水解破壞,蛋白多糖的含量也因此而減少[15]。氨基葡萄糖不僅能夠促進關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中膠原的合成,還具有抑制彈性蛋白酶、溶酶體酶等水解酶的釋放,促進成纖維細胞、單核巨噬細胞的移動,抑制炎癥因子或肉芽組織增生范圍繼續(xù)擴大[16]。鹽酸氨基葡萄糖對蛋白多糖的合成有促進作用,蛋白多糖是細胞膜和細胞間質(zhì)重要的構(gòu)成成分,能夠穩(wěn)定二者之間的連接[17],給軟骨細胞的增長提供穩(wěn)定環(huán)境,關(guān)節(jié)軟骨的代謝活動增強,關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)得到改善,對關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)和保護起著重要的作用[18]。
當(dāng)骨性關(guān)節(jié)炎疾病中軟骨細胞發(fā)生凋亡時[19],SNP可產(chǎn)生外源性一氧化氮(nitrous oxide,NO),NO是由于一氧化氮合酶作用于精氨酸產(chǎn)生的,參與機體多個系統(tǒng)的病理生理過程[20]。Maneiro等[21]將體外培養(yǎng)的軟骨細胞與較高濃度的SNP溶液共培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn),軟骨細胞發(fā)生了明顯的凋亡,其機制與SNP產(chǎn)生NO有關(guān)[22]。在既往研究中,有研究者認為NO在最常見的cGMP途徑中作用于GTP環(huán)化酶,與血紅素中的亞鐵離子結(jié)合,使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,催化GTP產(chǎn)生cGMP的含量。同時,GTP增加后也促進了影響細胞凋亡的相關(guān)基因如bcl-2、P53等蛋白的合成[23],從而影響細胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展[24]。在本實驗中,中西結(jié)合含藥血清組能夠明顯降低SNP(NO)誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡模型中軟骨細胞的凋亡率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);可能與中西結(jié)合血清組能夠減少NO含量,抑制軟骨細胞凋亡的發(fā)生,延緩關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變,促進關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用有關(guān)。
將傳統(tǒng)經(jīng)方補腎壯筋湯與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物鹽酸氨基葡萄糖聯(lián)合,制備大鼠含藥血清通過實驗研究,中西結(jié)合血清組與單純血清組、中藥血清組及西藥血清組方比較對大鼠軟骨細胞增殖具有明顯的優(yōu)勢,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),促進軟骨細胞中II型膠原蛋白表達也明顯優(yōu)于其他各實驗組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。說明中西結(jié)合方式具有很好的協(xié)同作用,其作用機制可能與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)合成有關(guān),降解導(dǎo)致細胞代謝失衡的相關(guān)因素,減輕炎癥因子對軟骨細胞的影響,為中西醫(yī)藥物聯(lián)合治療骨性關(guān)節(jié)炎提供有價值的綜合化治療方案。
近年來,研究者對中醫(yī)藥藥理作用上有了更深層次的認知和了解,從病人的整體觀入手,辨證施治,中醫(yī)治病重在辨證與辨病相結(jié)合,更加適用于患者本身[25-26]。補腎壯筋湯作為骨傷疾病中的經(jīng)典方劑在治療腎虛腰痛、腰椎間盤突出癥、退行性骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等疾病中已取得了良好的效果[27-28]。聯(lián)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)藥物鹽酸氨基葡萄糖的治療機理,必然能夠進一步提高療效,為廣大患者服務(wù),提高患者生活、工作質(zhì)量,減輕患者的疼痛,為延緩及治療骨性關(guān)節(jié)炎提供更為有效、安全的一種治療方式。