李宇 王偉 邱裕佳

1.葫蘆島市中心醫(yī)院，遼寧 葫蘆島 125000 2.錦州醫(yī)科大學骨外科學研究所，遼寧 錦州 121000 3.遼寧省醫(yī)學組織工程重點實驗室，遼寧 錦州 121000 4.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000

骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱骨質增生性關節(jié)炎、退行性關節(jié)炎等，是一種進行性慢性發(fā)展的骨關節(jié)疾病[1]，以膝關節(jié)發(fā)病為多見，關節(jié)軟骨受損是此疾病的重中之重，而軟骨細胞的增殖與凋亡對受損軟骨的修復起著至關重要的作用。骨性關節(jié)炎導致關節(jié)疼痛，有時伴有關節(jié)畸形，功能受限，此病已嚴重影響了中老年人的正常生活，給社會及家庭帶來嚴重的經(jīng)濟負擔[2]。

中醫(yī)學中認為，此疾屬于“骨痹”“筋痹”等范疇，所謂骨痹主要分為風寒濕癥、肝腎虧虛、濕熱蘊結、痰濕血瘀、當風寒濕邪入體，陰陽及臟腑失衡，血行不暢而瘀阻，加之肝腎之氣不足，而致筋骨不利。補腎壯筋湯首載于清·錢秀昌所著的《傷科補要》，此方具有補益肝腎、強筋壯骨、活血化瘀的功效，應用于膝OA的治療中效果顯著[3]。

鹽酸氨基葡萄糖(glucosamine sulfate，GS)在軟骨基質中分布較廣泛，屬于一種小分子化合物，不僅能夠有效促進軟骨蛋白聚糖的生成，而且也能有效控制炎細胞和介質的擴散[4]，降低軟骨細胞內毒性，臨床應用中已成為0到II級膝骨性關節(jié)炎的常規(guī)用藥，其治療效果在臨床上已得到公認[5]。

本實驗選用了中醫(yī)經(jīng)典方劑補腎壯筋湯與鹽酸氨基葡萄糖聯(lián)合應用，制備含藥血清，對大鼠膝軟骨細胞的增殖、凋亡及II型膠原蛋白表達方面進行檢測，為膝骨性關節(jié)炎的中西醫(yī)結合治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：本研究選用未交配的SPF級大鼠32只，雌雄不拘，體重為(200±20) g(錦州醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物質量合格證明號：211001200000172)，進行適應性飼養(yǎng)3 d，并隨機分為單純血清組(生理鹽水)、中藥血清組(補腎壯筋湯)、西藥血清組(鹽酸氨基葡萄糖)、中西結合血清組(補腎壯筋湯聯(lián)合鹽酸氨基葡萄糖)4組，每組8只。

1.1.2實驗藥物與制備：按照大鼠每日用藥量為人每千克每日用藥量的6.3倍，按大鼠胃容量為容積為每100 g 0.875 mL灌胃給藥。

補腎壯筋湯灌胃湯劑制備：熟地黃0.012 mg，當歸0.012 mg，牛膝0.010 mg，山茱萸0.012 mg，茯苓0.012 mg，續(xù)斷0.012 mg，杜仲0.010 mg，白芍0.010 mg，青皮0.005 mg，五加皮0.010 mg，以上藥物均采購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。水煎濃縮，用蒸餾水調節(jié)藥物濃度至100%，制成每毫升含生藥1 g。根據(jù)動物與人體每千克體重劑量折算公式計算每只大鼠的給藥劑量為7.52 mg/g。

鹽酸氨基葡萄糖(北京葡立藥業(yè)有限公司，批號：H20173212)灌胃劑制備：大鼠每日灌胃劑量為0.375 mg。

正常對照組灌胃劑制備：用等量0.9%氯化鈉注射液(華仁藥業(yè)股份有限公司，批號：H20023145)。

1.1.3主要試劑：硝普鈉(購自Sigma公司)，Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(購自DoJinDO公司)，MTT(購自索萊寶公司)，胎牛血清(購自SeraPro公司)，青鏈霉素、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液、購自HyClone公司)，阿爾新藍染色試劑盒(購自Sigma公司)，兔抗II型膠原蛋白多克隆抗體(購自Abcam公司)，SDS-PAGE凝膠試劑盒、蛋白提取試劑盒、定量試劑盒(均購自上海碧云天生物技術有限公司)。

1.1.4主要儀器：倒置顯微鏡(Olympus公司公司)；熒光顯微鏡(Leica公司)；紫外分光光度計(Tecan公司)；全自動電泳儀(Bio-Rad公司)；流式細胞檢測儀(BD公司)；CO2細胞孵育箱(Thermo Fisher公司)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠軟骨細胞分離培養(yǎng)：將大鼠斷頸處死，用PBS反復沖洗剪下的大鼠膝關節(jié)軟骨，制備成1 mm3的碎塊，在37 ℃條件下，用胰蛋白酶(0.25%)消化30 min，再用Ⅱ型膠原蛋白酶(0.1%)消化60 min，1 000 r/min離心10 min，收集細胞。加入含胎牛血清DMEM培養(yǎng)液(10%)中，以合適的濃度(1×106個/mL)接種于培養(yǎng)皿中，在CO2細胞孵育箱培養(yǎng)；48 h觀察細胞貼壁及生長狀態(tài)，每2～3 d換液1次，當鏡下觀察軟骨細胞匯合成片長滿大部分培養(yǎng)皿時，加入胰蛋白酶(0.25%)進行傳代養(yǎng)。細胞傳代至第4代時，方達到本實驗研究的要求，用于本實驗。

1.2.2含藥血清制備：各組大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，藥物灌胃1周，取材前禁食水，于第8天早灌胃2 h后，先用10%水合氯醛按大鼠體重每百克0.3 mL腹腔注射進行麻醉，采用腹主動脈取血法收取血液，4 ℃低溫保存4 h后，以3 000 r/min的速度離心30 min，取上清，用0.22 μm濾膜除菌分裝，-80 ℃保存待用。

1.2.3軟骨細胞阿爾新藍染色：按阿爾新藍染色試劑盒配置液體，染色方法：棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，5 min/次，4%多聚甲醛固定30 min(室溫)，PBS漂洗3次，0.1 N HCL溶液浸洗5 min時PH值降至1.0，阿爾新藍染色過夜，0.1 N HCL漂洗3次，5 min/次，去除背景，鏡下觀察。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖活力：計數(shù)以5×104個/mL濃度的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中。實驗分組：空白對照組、單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結合血清組，除空白對照組以外其余各組予以相應含0.6%、1.2%、2.4%含藥血清的培養(yǎng)基處理。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，于CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入200 μL DMSO。用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm處檢測各孔的吸光度值。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡：制備大鼠軟骨細胞懸液(1×106個/mL)接種于培養(yǎng)皿中，在5%CO2培養(yǎng)箱中37 ℃預培養(yǎng)24 h。加入終濃度為2 mmol/L的SNP作用24 h制作軟骨細胞凋亡模型。將凋亡軟骨細胞分為單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結合血清組，分別予以相應含1.2%含藥血清的培養(yǎng)基處理72 h。用胰蛋白酶消化并收集細胞，PBS洗2～3次，將細胞濃度調整為1×106個/mL。參照凋亡試劑盒的步驟說明，分別加入Annexin V-FITC(5 μL)、PI(5 μL)，4 ℃避光染色15 min，上機分析。

1.2.6Western blot法檢測II型膠原蛋白的表達：收集實驗各組細胞，加入裂解液裂解細胞提取蛋白。將各組蛋白按照BCA法調整至相同濃度。每上樣孔加入等量蛋白，10%的SDS-PAGE膠分離電泳。半干法將蛋白轉至PVDF膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃過夜，次日，TBST洗膜，再加入二抗室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光試劑顯像，掃描條帶并采集圖像分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果與分析

2.1 原代軟骨細胞提取及阿爾新藍染色鑒定

在倒置顯微鏡下觀察體外分離培養(yǎng)大鼠的原代軟骨細胞，細胞大體呈圓球形，懸浮狀態(tài)，約12 h后開始貼壁，1～2 d后部分細胞貼壁伸展，呈三角形、多角形。部分細胞出現(xiàn)分裂相，3～5 d大部分細胞貼壁較完全，增殖分裂加快。傳代至4代時，可以觀察到細胞生長速度加快，細胞周邊可見具有較明顯折光性的細胞外基質，細胞呈片狀生長，可呈明顯的“鋪路石”狀外觀。按照阿爾新藍染色試劑盒步驟進行染色后，倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞多呈多角形，胞質呈均質狀，較疏松，大部分可見到核仁，少數(shù)也可見分裂相，細胞漿和胞膜呈藍色，證明培養(yǎng)的軟骨細胞合成和分泌蛋白聚糖(見圖1)。

圖1 軟骨細胞阿爾新藍染色 A：放大倍數(shù)×100；B：放大倍數(shù)×200。Fig.1 Alcian blue staining of chondrocytes. A: × 100; B: × 200.

2.2 MTT法檢測細胞增殖活力

采用MTT法檢測實驗各組的OD值，以明確中藥、西藥及其聯(lián)合治療在不同血清濃度下，對細胞增殖活力的影響。雙因素方差分析結果顯示，與單純血清組、中藥血清組、西藥血清組比較，中西結合血清組OD值明顯增高，且差異具有統(tǒng)計學意義(F=15.76，P<0.01)；不同血清濃度比較，血清濃度為1.2%時對細胞活性的促進作用最為顯著(F=13.69，P<0.01)；組間兩兩比較顯示，中西結合含藥血清濃度為1.2%時，細胞OD值明顯高于其他各治療組(見圖2)。此結果說明中西結合含藥血清組促進軟骨細胞增殖明顯優(yōu)于單純血清組、中藥及西藥組，但不隨含藥血清濃度的增加呈正比例遞增，當中西結合含藥血清濃度為1.2%時，對軟骨細胞的增殖作用最為顯著。

圖3 流式細胞儀檢測細胞凋亡Fig.3 Flow cytometry to detect apoptosis

圖2 MTT法檢測細胞增殖活力Fig.2 MTT assay for cell proliferation

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結果顯示，單純血清組、中藥血清組、西藥血清組、中西結合血清組細胞凋亡率分別為(91.58±0.87)%、(81.68±1.09)%、(12.32±0.44)%、(1.54±0.87)%；各組間比較存在明顯差異且具有統(tǒng)計學意義(F=119.80，P<0.01)，其中中西醫(yī)結合血清組降低軟骨細胞凋亡率明顯低于單純血清組、中藥血清組及西藥血清組。此結果說明中西醫(yī)結合組能夠明顯降低軟骨細胞的凋亡，對軟骨細胞有明顯的保護作用(見圖3)。

2.4 Western blot檢測II型膠原蛋白的表達

采用Western blot檢測上述4組中II型膠原蛋白的表達水平。結果顯示，各組比較均存在差異且具有統(tǒng)計學意義(F=407.5，P<0.01)，其中中西醫(yī)結合血清組二型膠原蛋白的表達(灰度值=1.33±0.037)均明顯高于中藥血清組、西藥血清組及單純血清組(灰度值=0.99±0.019、1.11±0.026、0.61±0.017)。此結果說明，中西醫(yī)結合血清組能夠明顯促進軟骨細胞中II型膠原蛋白的表達(見圖4)。

圖4 Western blot檢測II型膠原蛋白的表達Fig.4 Expression of collagen type II detected with Western blotting

3 討論

骨性關節(jié)炎的核心是關節(jié)軟骨退行性改變，伴周圍骨質增生的一種慢性進行性發(fā)展的疾病[6]。軟骨細胞數(shù)量的減少或大量凋亡無疑會加速疾病的進程。因此，促軟骨細胞增殖[7]及降低軟骨細胞凋亡率[8]，是防治以及治療骨性關節(jié)炎的有效途徑之一。

補腎壯筋湯傳承于《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》中的精辟，清·錢秀昌結合自己的實踐經(jīng)驗于1808年所著《傷科補要》記載[9]，此方中各味藥相輔相成，熟地黃、山茱萸為君藥，具有填精益髓、肝腎同補的作用；續(xù)斷、杜仲、五加皮為臣藥，增進補益肝腎、強筋壯骨、祛風除濕的作用；當歸補血活血，白芍斂陰和營、柔肝止痛，茯苓健脾和胃、化痰除濕，青皮行氣疏肝，同為佐藥；牛膝補益肝腎、強筋壯骨、活血通經(jīng)，引火(血)下行，使方中諸藥直達病癥為使藥[10]。諸藥合用可以達到補益肝腎、強筋壯骨的功效。而膝關節(jié)軟骨損傷在祖國醫(yī)學古籍中并無明確記載，但從此疾的病因及癥狀等應歸屬于痹癥、膝痹、骨痹、痿證等范疇[11]。肝主筋，腎主骨，肝腎同源，筋約束骨骼構成關節(jié)而產(chǎn)生運動，筋骨是由肝腎的精氣和氣血來充養(yǎng)的。當肝血不足、腎元虧虛時骨骼也會發(fā)生異常的改變，氣血不足，導致經(jīng)絡瘀滯，不通則痛，而補腎壯筋湯不僅可以加速局部的血液循環(huán)，其強筋壯骨的功效可以使關節(jié)退變或損傷的軟骨得到改善及修復，從而達到改善和防治OA病情發(fā)展的目的[12]。

既往研究中，研究者認為補腎壯筋湯能夠有效抑制OA的軟骨發(fā)生退行性改變，通過抑制軟骨基質中的纖維變性，降低炎癥細胞和蛋白多糖的含量，增加透明質酸的含量；同時也是天然產(chǎn)物化合物的特殊子集，因此能夠提高細胞抗氧化酶的活動，避免自由基對軟骨細胞的病理性損害，從而促進軟骨細胞的自我增殖與修復[13]。在本實驗中，中藥組對軟骨細胞增殖的增殖作用明顯高于單純血清組，對軟骨細胞中II型膠原蛋白的表達也明顯高于單純血清組，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

鹽酸氨基葡萄糖是一種小分子氨基多糖，是軟骨基質糖胺聚糖的主要構成成分，在已受損軟骨的修復過程中有著極其重要的作用[14]，當關節(jié)內軟骨因退變或損傷出現(xiàn)裂縫時，可引起肉芽組織增生，軟骨基質水解破壞，蛋白多糖的含量也因此而減少[15]。氨基葡萄糖不僅能夠促進關節(jié)軟骨基質中膠原的合成，還具有抑制彈性蛋白酶、溶酶體酶等水解酶的釋放，促進成纖維細胞、單核巨噬細胞的移動，抑制炎癥因子或肉芽組織增生范圍繼續(xù)擴大[16]。鹽酸氨基葡萄糖對蛋白多糖的合成有促進作用，蛋白多糖是細胞膜和細胞間質重要的構成成分，能夠穩(wěn)定二者之間的連接[17]，給軟骨細胞的增長提供穩(wěn)定環(huán)境，關節(jié)軟骨的代謝活動增強，關節(jié)軟骨結構得到改善，對關節(jié)軟骨的修復和保護起著重要的作用[18]。

當骨性關節(jié)炎疾病中軟骨細胞發(fā)生凋亡時[19]，SNP可產(chǎn)生外源性一氧化氮(nitrous oxide，NO)，NO是由于一氧化氮合酶作用于精氨酸產(chǎn)生的，參與機體多個系統(tǒng)的病理生理過程[20]。Maneiro等[21]將體外培養(yǎng)的軟骨細胞與較高濃度的SNP溶液共培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，軟骨細胞發(fā)生了明顯的凋亡，其機制與SNP產(chǎn)生NO有關[22]。在既往研究中，有研究者認為NO在最常見的cGMP途徑中作用于GTP環(huán)化酶，與血紅素中的亞鐵離子結合，使其空間結構發(fā)生改變，催化GTP產(chǎn)生cGMP的含量。同時，GTP增加后也促進了影響細胞凋亡的相關基因如bcl-2、P53等蛋白的合成[23]，從而影響細胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展[24]。在本實驗中，中西結合含藥血清組能夠明顯降低SNP(NO)誘導軟骨細胞凋亡模型中軟骨細胞的凋亡率，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；可能與中西結合血清組能夠減少NO含量，抑制軟骨細胞凋亡的發(fā)生，延緩關節(jié)軟骨的退行性改變，促進關節(jié)軟骨修復的作用有關。

將傳統(tǒng)經(jīng)方補腎壯筋湯與現(xiàn)代醫(yī)學藥物鹽酸氨基葡萄糖聯(lián)合，制備大鼠含藥血清通過實驗研究，中西結合血清組與單純血清組、中藥血清組及西藥血清組方比較對大鼠軟骨細胞增殖具有明顯的優(yōu)勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，促進軟骨細胞中II型膠原蛋白表達也明顯優(yōu)于其他各實驗組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明中西結合方式具有很好的協(xié)同作用，其作用機制可能與調節(jié)細胞外基質合成有關，降解導致細胞代謝失衡的相關因素，減輕炎癥因子對軟骨細胞的影響，為中西醫(yī)藥物聯(lián)合治療骨性關節(jié)炎提供有價值的綜合化治療方案。

近年來，研究者對中醫(yī)藥藥理作用上有了更深層次的認知和了解，從病人的整體觀入手，辨證施治，中醫(yī)治病重在辨證與辨病相結合，更加適用于患者本身[25-26]。補腎壯筋湯作為骨傷疾病中的經(jīng)典方劑在治療腎虛腰痛、腰椎間盤突出癥、退行性骨關節(jié)炎、骨質疏松等疾病中已取得了良好的效果[27-28]。聯(lián)合現(xiàn)代醫(yī)學藥物鹽酸氨基葡萄糖的治療機理，必然能夠進一步提高療效，為廣大患者服務，提高患者生活、工作質量，減輕患者的疼痛，為延緩及治療骨性關節(jié)炎提供更為有效、安全的一種治療方式。