武 江，楊 陽，楊 冉，郭愛華，張 超

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031）

耬斗菜（Aquilegia vulgaris L.）為毛茛科耬斗菜屬多年生草本宿根植物，耐寒，根肥大，圓柱形，外皮黑褐色，有少數(shù)分枝，原產(chǎn)于歐洲和北美洲[1]。我國(guó)有豐富而珍貴的耬斗菜野生資源，分布于青海東部、甘肅、寧夏、陜西、山東、河北、山西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等地[2]。耬斗菜具有較高的觀賞價(jià)值，此外其嫩莖、葉營(yíng)養(yǎng)豐富可食用，根含糖，可制作飴糖或釀酒，全草或根可做婦科用藥，有免疫活性、抗腫瘤活性、肝保護(hù)作用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。近年來，隨著對(duì)植物多糖研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)多糖對(duì)腫瘤、肝炎、心血管病等疾病的預(yù)防和治療[4]，以及調(diào)節(jié)糖代謝和抗衰老等方面具有獨(dú)特的生物活性[5]。因其毒副作用小、安全性強(qiáng)、功能多等特點(diǎn)而被越來越多的人關(guān)注，相關(guān)的研究也日益受到重視[6]。對(duì)華北耬斗菜的化學(xué)成分分離后鑒定出13 種化合物[7]。另有研究表明，耬斗菜提取物對(duì)黑腹果蠅具有抗衰老作用[8]。在植物多糖的提取方法中，多采用熱提法[9]、回流法和超聲波法[10]，回流波法與超聲波法曾應(yīng)用在提取蒙藥耬斗菜多糖中，但是目前采用響應(yīng)面法分析優(yōu)化耬斗菜多糖的最佳提取工藝還鮮有報(bào)道。

本研究以大花耬斗菜為試材驗(yàn)料，通過微波方法提取根系多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken 對(duì)耬斗菜多糖的提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面法（RSM）分析優(yōu)化，考察關(guān)鍵工藝參數(shù)對(duì)耬斗菜根系多糖提取率的影響，旨在為進(jìn)一步探究耬斗菜多糖的生物學(xué)活性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為大花耬斗菜（Aquilegia glandulosa Fisch.ex Link.），2019 年6 月定植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站。

1.2 試劑與儀器

丙酮、葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醚、無水乙醇，均為分析純。

可見分光光度計(jì)VIS-723N（北京瑞利分析儀器有限公司）、萬能破碎機(jī)FW80（天津泰斯特儀器有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱GZX-9146MBE（上海博訊有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、冷藏冷凍冰箱BCD-252KSA（青島海爾股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 耬斗菜根系粗多糖的提取 挖取大花耬斗菜根系，烘干并研磨成粉末，過0.177 mm 篩。準(zhǔn)確稱取耬斗菜根系粉末0.2 g，倒入燒杯中，按照一定的料液比與蒸餾水混合，后置于微波爐中進(jìn)行輔助提取。將輔助提取后的提取液于80 ℃熱水浸提1 h，離心20 min（3 500 r/min），取上清液，加入3 倍體積的無水乙醇，在4 ℃冰箱中放置過夜，后離心20 min（3 500 r/min）得沉淀，再依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚清洗，通風(fēng)干燥，得粗多糖。

1.3.2 耬斗菜根系多糖含量的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)量粗多糖含量[11-15]，并于490 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值?；貧w方程為：a＝1.186x-0.007 8（R2＝0.994），其中，x 為490 nm 的吸光值，a 為還原糖質(zhì)量濃度（mg/mL）。

式中，a 為回歸方程計(jì)算所得多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；b 為稀釋倍數(shù)；c 為耬斗菜根系多糖相對(duì)于葡萄糖的換算因子1.272；M 為耬斗菜粉末質(zhì)量。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 在1.3.2 試驗(yàn)基礎(chǔ)上，使用微波輔助提取法，設(shè)置不同的微波時(shí)間（20、30、40、50、60 s）、微波功率（20、40、60、80、100 W）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）），進(jìn)行單因素試驗(yàn)，檢測(cè)所得到的耬斗菜根系多糖粗提液中多糖含量，并計(jì)算粗多糖提取率。

1.3.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析 使用Design Expert 8.0.6 軟件中的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以微波時(shí)間（X1）、微波功率（X2）、料液比（X3）為自變量，以多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行3 因素3 水平響應(yīng)面法分析試驗(yàn)。將各因素以1、0、-1 編碼，其中，0 為最佳條件，-1 為較低水平，1 為較高水平（表1）。通過對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的回歸方差分析，優(yōu)化耬斗菜根系多糖的提取工藝條件。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 微波工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 微波時(shí)間對(duì)耬斗菜根系多糖提取率的影響由圖1 可知，在微波功率60 W、料液比1∶20（g/mL）的條件下，耬斗菜根系多糖提取率隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢增大，當(dāng)微波時(shí)間超過50 s 后，多糖提取率呈快速下降趨勢(shì)。這是因?yàn)殡S著微波時(shí)間的增加，提取溫度升高，多糖降解率也增加，從而導(dǎo)致提取率下降。因此，考慮50 s 為微波法中耬斗菜根系多糖提取的適宜微波時(shí)間。

2.1.2 微波功率對(duì)耬斗菜根系多糖提取率的影響由圖2 可知，在微波時(shí)間30 s、料液比1∶20（g/mL）條件下，隨著微波功率的增加，耬斗菜根系多糖提取率增加，微波功率為40 W 時(shí)，耬斗菜根系多糖提取率達(dá)到最大，繼續(xù)提高微波功率，則多糖提取率下降。這可能是因?yàn)槲⒉üβ试龃笤斐商崛∫簻囟壬撸糠侄嗵欠纸庠斐商崛÷式档汀?/p>

2.1.3 料液比對(duì)耬斗菜根系多糖提取率的影響 由圖3 可知，在微波時(shí)間30 s、微波功率60 W 的條件下，隨著料液比的增加，多糖提取率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，耬斗菜根系多糖提取率達(dá)到最大。但若繼續(xù)增大料液比，多糖溶出量反而降低。這是因?yàn)榱弦罕冗_(dá)到一定比值時(shí)，根系中的多糖基本全部溶出，擴(kuò)散達(dá)平衡，繼續(xù)增大溶劑量也不會(huì)促進(jìn)多糖的提取，反而會(huì)加重后續(xù)濃縮負(fù)擔(dān)[16]。

2.2 微波法多糖提取工藝的響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理對(duì)耬斗菜根系多糖提取條件進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)果如表2 所示。

表2 微波法響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以耬斗菜根系多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，得到提取率對(duì)微波時(shí)間（X1）、微波功率（X2）、料液比（X3）的回歸方程為Y＝-32.434 726＋7.716 296X1＋3.139 657X2-0.019 000X3-0.058 190X1X2＋5.890 070X1X3＋0.001 008X2X3-0.001 488X12-0.025 040X22＋0.002 029X32。對(duì)模型方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，由表3 可知，回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P＝0.110 6），實(shí)際試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)具有高度相關(guān)性。表明模型與試驗(yàn)值擬合良好，試驗(yàn)方法可信度高，該模型可以對(duì)耬斗菜根系多糖的提取率進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)和分析。從表3 還可以看出，微波時(shí)間、料液比對(duì)耬斗菜根系多糖提取率有極顯著影響，微波功率對(duì)耬斗菜根系多糖提取率的影響不顯著。

表3 微波法回歸模型

2.2.2 響應(yīng)面直觀分析 依據(jù)回歸方程，可以獲得耬斗菜根系多糖提取的微波時(shí)間、微波功率和料液比兩兩因素交互作用的響應(yīng)曲面和等高線，如圖4、5、6 所示。

從圖4、5、6 可以看出，任何2 個(gè)交互因素的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，微波時(shí)間和微波功率的交互作用、微波時(shí)間和料液比的交互作用以及料液比和微波功率的交互作用對(duì)多糖提取率的影響均為顯著（等高線為橢圓形）。同一料液比水平下，隨微波時(shí)間和微波功率的增加，多糖提取率逐漸增加，到達(dá)最高點(diǎn)后下降。即多糖得率在合適的微波時(shí)間和微波功率下具有極大值，該極大值存在于響應(yīng)面的頂部，也就是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)[17]。同理可得，微波時(shí)間和料液比、微波功率和料液比這2 對(duì)交互因素之間也具有極大值。通過軟件分析得到，提取耬斗菜根系多糖的最優(yōu)條件為：提取時(shí)間44.57 s、提取功率56.47 W、料液比1∶20.82（g/mL）。

2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，根據(jù)試驗(yàn)條件調(diào)整的最佳提取條件為：提取時(shí)間44 s、提取功率60 W、料液比1∶21（g/mL）。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證和重復(fù)性考察，得到真實(shí)最佳得率為17.64%，與理論得率18.21%僅相差0.57 百分點(diǎn)。進(jìn)一步表明，所得模型可以較好地預(yù)測(cè)耬斗菜根系多糖的提取情況。

3 結(jié)論與討論

本研究選擇微波時(shí)間、微波功率和料液比3 個(gè)對(duì)耬斗菜根系多糖提取率影響較大的因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken 設(shè)計(jì)，建立相應(yīng)的二次回歸方程。通過方差分析和響應(yīng)曲面分析發(fā)現(xiàn)，微波時(shí)間和料液比為耬斗菜根系多糖提取過程中的顯著因素，并且它們的二次項(xiàng)對(duì)多糖提取率的響應(yīng)面曲線有非常顯著的影響。同時(shí)，料液比分別與微波時(shí)間、微波功率之間的交互作用顯著。

利用響應(yīng)面法得到耬斗菜根系多糖的微波法提取過程優(yōu)化的工藝條件為：提取時(shí)間44 s、提取功率60 W、料液比1∶21（g/mL）；在此條件下，多糖提取率為17.64%，與理論值接近，模型方程高度顯著，擬合度良好，可以較好地預(yù)測(cè)耬斗菜多糖的提取得率。

目前，植物藥物中粗多糖的制備主要用常規(guī)的水提醇沉法[17]。本研究對(duì)大花耬斗菜多糖的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化，通過響應(yīng)曲面優(yōu)化微波法中各提取條件，得到了較為理想的大花耬斗菜根系多糖的提取工藝，為進(jìn)一步研究耬斗菜屬其他植物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。