邱相坡，梁 璇，王文斌

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

連翹（Forsythia suspense）是木犀科（Oleaceae）連翹屬（Forsythia）落葉灌木，適宜生長在灌木叢、林下、草叢或山谷疏林中[1]。連翹在我國分布較廣，除華南地區(qū)外其他各地都有栽培，多分布在山東、山西、陜西、河南、四川等地[2]。連翹果實(shí)多呈長卵形、卵形等，表面具不規(guī)則縱皺紋和凸起的斑點(diǎn)，頂端銳尖[3]。青翹是連翹的一種，果實(shí)剛成熟且尚帶綠色時(shí)采收得到，采收期一般在10 月下旬，其表面呈綠褐色，氣微香，味苦[4]。

連翹具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、消腫散結(jié)的作用[5]，可用于外感風(fēng)熱、溫病發(fā)熱、瘡瘍腫痛等癥狀，它具有良好的藥理作用，如抗炎、抗病原微生物、解熱、利尿等[6-9]。同時(shí)，大量臨床研究證實(shí)，連翹對(duì)中度和輕度抑郁癥有效，其副作用較傳統(tǒng)的抗抑郁藥物更溫和[10]。

黃酮類化合物是連翹果實(shí)中主要有效成分之一，由色原烷或色原酮衍生而來，廣泛分布在植物的各個(gè)部位，是植物中的次級(jí)代謝產(chǎn)物[4]。黃酮類化合物可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低血清膽固醇、清除生物體內(nèi)自由基、改善血液循環(huán)、抗肝臟毒性等，同時(shí)能夠增強(qiáng)免疫力，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，對(duì)治療心血管疾病也有一定效果[10]，在食品、藥品、保健品等方面應(yīng)用廣泛。

黃酮類物質(zhì)種類多且分布廣，對(duì)它進(jìn)行提取有許多方法，如超聲輔助有機(jī)溶劑提取法、微波輔助法、超臨界流體萃取法、超聲波提取法、纖維素酶解法、濁點(diǎn)萃取法、大孔樹脂吸附法等[4，11-13]，這些方法分別在不同程度上存在安全性不足、對(duì)溫度要求嚴(yán)格、操作流程復(fù)雜、用時(shí)較長、應(yīng)用范圍有限、分離效果差等缺點(diǎn)。而閃式提取法利用高速剪切攪拌振動(dòng)、超動(dòng)分子滲濾與負(fù)壓過濾等技術(shù)，在室溫和溶劑存在下，把植物藥用部位在幾秒內(nèi)破碎成細(xì)顆粒，在短時(shí)間內(nèi)使組織細(xì)胞內(nèi)外的有效成分達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，最后用過濾的方法實(shí)現(xiàn)總黃酮提取[14]。閃式提取法用時(shí)短、效率高，在常溫條件下即可完成，使用方便且不受熱破壞，適用范圍廣泛，能最大限度地保留植物有效成分，結(jié)構(gòu)緊湊，使用安全可靠[15]。

響應(yīng)面法（RSM）利用合理試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)構(gòu)建多元二次回歸方程，分析得到最優(yōu)工藝參數(shù)。可用于解決多變量問題，在生物學(xué)、化學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。相較于傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)等方法，響應(yīng)面法構(gòu)造了明確的函數(shù)表達(dá)式，得到的最優(yōu)方案更精確。

本試驗(yàn)首次利用閃式提取法提取連翹果實(shí)中的總黃酮，選取液料比、閃式提取時(shí)間、閃式提取電壓這3 個(gè)單因素，利用響應(yīng)面法建立模型，為優(yōu)化連翹果實(shí)中黃酮的工業(yè)提取工藝提供一定的理論參考，也為提升黃酮的利用價(jià)值、獲得更高的經(jīng)濟(jì)收益提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試連翹品種為青翹，采購于山西省臨汾市古縣。將連翹放入60 ℃干燥箱中烘干以除去水分，直至用電子天平稱量為恒質(zhì)量。將干燥后的連翹果實(shí)通過粉碎機(jī)粉碎成粉末，過0.42 mm 篩，密封入潔凈的藍(lán)蓋瓶，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法 取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，加入適量60%乙醇，振蕩搖晃以充分溶解，完全轉(zhuǎn)移并用60%的乙醇定容到100 mL，得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，存放于4 ℃冰箱備用[2，16]。

取6 個(gè)25 mL 容量瓶，分別加入0、1、2、3、4、5 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，加入5%NaNO2溶液各0.3 mL，搖勻并靜置6 min；再加入10%Al（NO3）3溶液各0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用60%乙醇定容至25 mL，搖勻，靜置15 min[17]，以不含蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的溶液為空白對(duì)照，在510 nm 波長下測(cè)吸光度值，生成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

1.2.2 連翹果實(shí)總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱取2.00 g上述連翹果實(shí)粉末于藍(lán)蓋瓶中，加入60%乙醇溶液50 mL，用閃式提取器在110 V 電壓下提取80 s。將得到的懸濁液完全轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，經(jīng)6 000 r/min離心6 min，將上清液轉(zhuǎn)入潔凈的藍(lán)蓋瓶，即可得到連翹果實(shí)試液，存放于4 ℃冰箱中，待測(cè)。

1.2.3 連翹果實(shí)總黃酮的測(cè)定 精密量取連翹果實(shí)試液2 mL，移入25 mL 容量瓶中，用移液槍吸取0.3 mLNaNO2溶液，加入容量瓶中，搖勻，靜置6 min；加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入4%NaOH 溶液4 mL，用60%乙醇定容至25 mL，搖勻并靜置15 min。將容量瓶中的溶液移入離心管中，經(jīng)6 000 r/min 離心6 min 后，轉(zhuǎn)移上清液至潔凈的藍(lán)蓋瓶內(nèi)，稀釋10 倍后在510 nm 波長處測(cè)定吸光度值，并計(jì)算提取率。

式中，E 為總黃酮提取率；C 表示提取液中的總黃酮濃度（mL/g）；V 表示提取液的體積（mL）；n 表示提取液的稀釋倍數(shù)；m 表示配制連翹果實(shí)試液時(shí)使用的藥粉質(zhì)量（g）。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 液料比試驗(yàn) 確定試驗(yàn)所用液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，由于需要將閃式提取器破碎提取刀頭浸入試液液面以下，在潔凈的藍(lán)蓋瓶中分別準(zhǔn)確稱取4.00、3.00、2.00、2.00、2.00 g連翹果實(shí)粉末，并分別加入40、45、40、50、60 mL 的60%乙醇溶液，搖勻，在閃式提取電壓100 V 的條件下提取90 s。將獲得的試液轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中，經(jīng)6 000 r/min 離心6 min 后，將上清液分別倒入5 個(gè)潔凈的藍(lán)蓋瓶，密封儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中待測(cè)。

準(zhǔn)備6 個(gè)潔凈干燥的25 mL 容量瓶，向其中5 個(gè)分別加入上一步制得的連翹果實(shí)試液各2.00 mL，另外1 個(gè)容量瓶作為對(duì)照。用移液槍分別量取5%NaNO2溶液0.3 mL 加入容量瓶中，搖勻并靜置6 min；分別加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；再分別向各個(gè)容量瓶中加入4%NaOH 溶液4 mL，并用60%乙醇定容，搖勻，靜置15 min。將所得的溶液轉(zhuǎn)入離心管，6 000 r/min 離心6 min 后得到上清液。將其稀釋10 倍并檢測(cè)510 nm 波長下的吸光度。計(jì)算連翹果實(shí)中總黃酮提取率，確定最佳液料比。

1.3.2 乙醇濃度試驗(yàn) 設(shè)置閃式提取時(shí)間、閃式提取電壓、連翹果實(shí)試液液料比分別為90 s，110 V，25∶1。向5 個(gè)藍(lán)蓋瓶中分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，剩余步驟同1.3.1，確定最佳乙醇濃度。

1.3.3 閃式提取時(shí)間試驗(yàn) 設(shè)置閃式提取電壓、連翹果實(shí)試液液料比、乙醇濃度分別為110 V，25∶1，60%。分別閃式提取70、80、90、100、110 s，剩余步驟同1.3.1，確定最佳閃式提取時(shí)間。

1.3.4 閃式提取電壓試驗(yàn) 設(shè)置閃式提取時(shí)間、連翹果實(shí)試液液料比、乙醇濃度分別為80 s，25∶1，60%。分別在90、100、110、120、130 V 下提取，剩余步驟同1.3.1，確定最佳閃式提取電壓。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分析單因素試驗(yàn)結(jié)果可以得出，液料比、閃式提取時(shí)間和閃式提取電壓這3 個(gè)單因素對(duì)連翹果實(shí)中黃酮類物質(zhì)的提取率有較大影響。利用Design-Export 8.0.6 軟件中的Box-Behnken 程序，進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以確定連翹果實(shí)中總黃酮提取的最佳工藝。所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)因素及編碼列于表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及編碼

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

整個(gè)試驗(yàn)過程均至少重復(fù)3 次，并采用Microsoft Excel 及SPSS 17.0 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算及顯著性差異分析。單因素試驗(yàn)中連翹總黃酮提取率結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 結(jié)果顯示，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝9.025x-0.003（R2＝0.999 6）。其中，自變量x 代表蘆丁質(zhì)量濃度（mg/mL），因變量y 為吸光度A。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 液料比對(duì)連翹果實(shí)總黃酮提取率的影響由圖2 可知，當(dāng)液料比為10∶1～25∶1（mL/g）時(shí)，連翹果實(shí)總黃酮的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)；而在25∶1～30∶1 的區(qū)間則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)，液料比為25∶1 時(shí)，連翹果實(shí)試液中總黃酮達(dá)到峰值。因此，可選擇連翹果實(shí)試液的液料比25∶1 作為最適液料比。

2.2.2 乙醇濃度對(duì)連翹果實(shí)總黃酮提取率的影響對(duì)圖3 的分析表明，乙醇濃度在40%～50%時(shí)連翹果實(shí)總黃酮的提取率平緩上升，在50%～60%提取率幾近持平而略有極小幅的升高，高于60%則呈下降趨勢(shì)。因此，乙醇濃度為60%時(shí)連翹果實(shí)總黃酮的提取率達(dá)到峰值。

2.2.3 閃式提取時(shí)間對(duì)連翹果實(shí)總黃酮提取率的影響 分析圖4 可知，提取時(shí)間為70～80 s 時(shí)，連翹果實(shí)總黃酮的提取率較大幅上升，在80～90 s 有明顯的下降趨勢(shì)，而在90 s 之后連翹果實(shí)總黃酮提取率的下降漸漸趨于平緩。因此，提取時(shí)間為80 s時(shí)連翹果實(shí)黃酮提取率最高。

2.2.4 閃式提取電壓對(duì)連翹果實(shí)總黃酮提取率的影響 分析圖5 可知，提取電壓為90～110 V 時(shí)，連翹果實(shí)黃酮的提取率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，電壓在110 V 后連翹果實(shí)的提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，提取電壓為110 V 時(shí)連翹果實(shí)黃酮提取率最高。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

對(duì)閃式提取連翹果實(shí)中總黃酮的條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)方案及其結(jié)果列于表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及測(cè)定結(jié)果

分析表2 中的數(shù)據(jù)可得如下回歸方程。

式中，Y 表示連翹果實(shí)總黃酮提取率。

對(duì)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果列于表3。對(duì)回歸方程以及表3 中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可得失擬項(xiàng)＝0.104＞0.05，說明該模型擬合程度良好；均方差P＜0.000 1，小于0.05，表明回歸模型顯著。CV＝1.11%，說明試驗(yàn)精確度良好；信噪比＝15.732＞3，表明該模型對(duì)連翹果實(shí)中總黃酮提取率的分析和預(yù)測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確；R2＝0.981 2，表明該模型擬合程度較高。

表3 回歸方程的方差分析

對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性分析，所得模型的一次項(xiàng)A、C 顯著（P＜0.05），B 不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2均顯著（P＜0.05）。各單因素對(duì)連翹果實(shí)總黃酮提取率的影響大?。篈＞C＞B，即連翹果實(shí)試液液料比＞閃式提取電壓＞閃式提取時(shí)間。

2.4 多因素間交互作用分析

由圖6～8 可知，連翹果實(shí)試液液料比和閃式提取時(shí)間2 個(gè)因素之間存在明顯的交互作用，連翹果實(shí)試液液料比與閃式提取電壓之間也有著較為明顯的交互作用，而閃式提取時(shí)間與閃式提取電壓之間交互作用不明顯。連翹果實(shí)總黃酮提取率受連翹果實(shí)試液液料比的影響最大，在25∶1～30∶1的某點(diǎn)提取率最高，閃式提取電壓在100～110 V的某電壓下連翹果實(shí)總黃酮提取率最高，而閃式提取時(shí)間在70～80 s 的某時(shí)刻有最高提取率。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)Design Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化分析獲得從連翹果實(shí)中提取總黃酮的最優(yōu)工藝如下：液料比為27.34∶1、閃式提取時(shí)間為79.84 s、閃式提取電壓為108.87 V，在此條件下，連翹果實(shí)總黃酮提取率理論值為18.256%。由于儀器精度等條件的限制，故采用連翹果實(shí)試液液料比為27∶1、閃式提取時(shí)間為80 s、閃式提取電壓為109 V 進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到連翹果實(shí)總黃酮提取率實(shí)際均值為18.030%，較為接近響應(yīng)面軟件分析所得到的理論值。由此可認(rèn)為，此試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦x擇合理，試驗(yàn)結(jié)果理想。

3 結(jié)論與討論

在研究乙醇濃度這一單因素時(shí)發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度對(duì)連翹果實(shí)總黃酮提取率的影響不大。乙醇濃度較低時(shí)提取率與乙醇濃度基本成正比，乙醇濃度在50%～60%時(shí)達(dá)到最高值并保持基本持平，而后逐漸下降，考慮到節(jié)能、高效等因素，在設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)時(shí)舍去該單因素[18-20]。

響應(yīng)面法分析得出利用閃式提取法提取連翹果實(shí)中的總黃酮最優(yōu)工藝為：液料比27.34∶1，提取時(shí)間為79.84 s，提取電壓為108.87 V，此條件下所得理論提取率為18.256%。利用超聲提取法提取連翹果實(shí)中總黃酮的試驗(yàn)所得到的最佳提取工藝為：超聲功率66.2%，溫度57.2 ℃，乙醇濃度56.2%，超聲提取40 min，所得理論最佳提取率為15.08%[19]。比較2 種提取方法，可以發(fā)現(xiàn)，閃式提取法所需時(shí)間更短，室溫下即可進(jìn)行提取，操作簡單易行，并且可以獲得更高的提取率。

此外，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)也廣泛應(yīng)用于優(yōu)化提取工藝中[1，21-23]，但它作為線性數(shù)學(xué)模型所設(shè)計(jì)的設(shè)計(jì)方法，只能分析離散性數(shù)據(jù)。響應(yīng)面法則采用非線性模型，可以在給出的區(qū)域找到明確的回歸方程，從而找到整個(gè)區(qū)域提取工藝的最優(yōu)值，預(yù)測(cè)性更好。

通過單因素試驗(yàn)以及響應(yīng)面設(shè)計(jì)模型，比較液料比、閃式提取時(shí)間、閃式提取電壓等條件對(duì)連翹果實(shí)總黃酮提取率的影響，得到閃式提取連翹果實(shí)中總黃酮的最優(yōu)方案。結(jié)果表明，各單因素對(duì)提取率的影響為：液料比＞閃式提取電壓＞閃式提取時(shí)間。從連翹果實(shí)中提取黃酮的最優(yōu)工藝：液料比為27∶1、閃式提取時(shí)間為80 s、閃式提取電壓為109 V，連翹果實(shí)總黃酮提取率的實(shí)際均值為18.030%。研究結(jié)果可為優(yōu)化連翹果實(shí)中總黃酮的提取工藝提供一定的理論參考。