葉健明，石寧蕙，楊群慧，蘇麗明，周建中，楊海燕

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

鷹嘴豆（Cicer arietinumL.）是世界第二大消費(fèi)豆類，產(chǎn)量居世界豆類第三，是目前世界上栽培面積較廣的食用豆類作物之一[1]。目前，中國(guó)對(duì)鷹嘴豆的食用主要以干制和鮮食為主，對(duì)鷹嘴豆蛋白的利用較少。蛋白質(zhì)是核心營(yíng)養(yǎng)素之一，可提供能量和氨基酸[2]，因而氨基酸的組成、含量及其消化吸收后的生物利用率是營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要性指標(biāo)[3]。鷹嘴豆富含人體所需的18種氨基酸[4]，8種必需氨基酸種類齊全、組成均衡，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白源[5]。Newman等[6]研究發(fā)現(xiàn)，鷹嘴豆蛋白的蛋白功效比值（PER）在2.8左右，消化率為79%~88%，對(duì)比試驗(yàn)表明鷹嘴豆蛋白質(zhì)量與大豆蛋白相似。進(jìn)一步開發(fā)、利用鷹嘴豆蛋白資源是解決蛋白質(zhì)不足的辦法之一，同時(shí)還能拓寬高附加值的鷹嘴豆產(chǎn)品。

近年來(lái)，功能性短肽的營(yíng)養(yǎng)性、生理活性和應(yīng)用價(jià)值已成為人們研究的熱點(diǎn)，功能性短肽在體內(nèi)比氨基酸更容易消化吸收[7-8]，還具有多種功能，如抗菌肽可調(diào)節(jié)免疫功能和殺死癌細(xì)胞[9]，抗氧化肽可以減少組織氧化[10]，保護(hù)機(jī)體。在我國(guó)，小麥肽已經(jīng)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，目前采用單酶作為工具酶水解蛋白很難在短時(shí)間內(nèi)獲得高水解度、高得率的功能性短肽，如何實(shí)現(xiàn)鷹嘴豆短肽產(chǎn)業(yè)化，已成為亟待解決的技術(shù)問(wèn)題[11]。遲曉星等[12]采用A.S1398中性蛋白酶水解大豆分離蛋白，水解時(shí)間為360 min，所得酶解液水解度10%。馬文鵬等[13]采用2709堿性蛋白酶水解鷹嘴豆分離蛋白，水解時(shí)間為360 min，所得酶解液水解度16.18%。周媛媛等[14]采用Protamex蛋白酶水解大豆分離蛋白，水解時(shí)間為240 min，所得酶解液水解度12.94%。劉冬等[15]采用菠蘿蛋白酶水解花生蛋白，發(fā)現(xiàn)水解時(shí)間382.68 min時(shí)酶解液水解度達(dá)23.40%。吳建中[16]采用Alcalase水解大豆蛋白，水解時(shí)間為300 min，所得酶解液水解度為12.7%，短肽得率70%，采用Protamex酶繼續(xù)水解Alcalase酶解物2 h，水解度可增至16%?？梢姡啾葐蚊杆?，多酶分步酶解可提高短肽的得率和水解度。因此，本研究以堿溶酸沉得到的鷹嘴豆蛋白為原料，在鷹嘴豆蛋白堿性蛋白酶Alcalase水解研究的基礎(chǔ)上，篩選合適的酶繼續(xù)水解Alcalase水解物制備鷹嘴豆短肽，對(duì)進(jìn)一步酶解工藝中的多種影響因素進(jìn)行研究，利用氨基酸自動(dòng)分析儀等測(cè)定鷹嘴豆短肽中的氨基酸組成及基本營(yíng)養(yǎng)成分，評(píng)價(jià)鷹嘴豆短肽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，為鷹嘴豆短肽的產(chǎn)業(yè)化和進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

鷹嘴豆蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制。

風(fēng)味蛋白酶（Flavorzyme，1.2×105U/g）、堿性蛋白酶（Alcalase 2.4 L，2.80×105U/g），丹麥 Novozymes公司產(chǎn)品；木瓜蛋白酶（Papain，5.02×105U/g）、復(fù)合蛋白酶（Protamex，1.653×105U/g）、中性蛋白酶（Neutrase，2.236×105U/g），廣西南寧龐博生物工程有限公司產(chǎn)品；牛血清蛋白、福林酚試劑，購(gòu)于北京市索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外分光光度計(jì)，HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，AL204型天平，TDL-5-A型離心機(jī)，PHS-3C型pH計(jì)，K1301型自動(dòng)定氮儀，ALPHA 1-2LD Plus型凍干機(jī)，LC-3A型氨基酸自動(dòng)分析儀，Waters 600型高效液相色譜儀，TSK-GEL 2000 SWXL色譜柱。

1.2 方法

1.2.1 鷹嘴豆蛋白的制備

脫脂鷹嘴豆粉→堿溶（料液比 1∶10（g/mL），溫度 30℃，時(shí)間 90 min，pH 10.0）→離心（3 500 r/min，25min）→上層清液→酸沉（pH4.5）→離心（4000r/min，10 min）→真空冷凍干燥[17]。

1.2.2 蛋白酶的篩選

根據(jù)諾維信等公司提供各種蛋白酶最適作用范圍，在各種蛋白酶的最佳條件下水解45 min（表1），分別測(cè)定各酶解物的得率和水解度。

表1 蛋白酶酶解條件Table 1 Enzymolysis conditions of proteases

1.2.3 堿性蛋白酶Alcalase對(duì)鷹嘴豆蛋白的酶解

堿性蛋白酶Alcalase對(duì)鷹嘴豆蛋白的酶解條件為：水解溫度50℃，酶與底物濃度比（[E]/[S]）為2%，pH 8.0反應(yīng)時(shí)間40 min[18]。

1.2.4 復(fù)合蛋白酶制備鷹嘴豆短肽單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

固定鷹嘴豆蛋白濃度為4%，在堿性蛋白酶Alcalase對(duì)鷹嘴豆蛋白酶解的條件上，其他因素基本條件為：中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme用量比1∶1，酶總用量5 000 U/g，pH 7.0，反應(yīng)溫度55℃，水解時(shí)間210 min，在此基礎(chǔ)之上考察復(fù)合酶用量（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000、7 000 U/g）、pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、酶解時(shí)間（90、120、150、180、210、240、270min）、酶解溫度（40、45、50、55、60、65、70 ℃）對(duì)水解度（DH）和短肽得率（TCA-NSI）的影響。反應(yīng)結(jié)束后90℃保溫10 min滅酶，分別測(cè)定水解度和短肽得率。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以短肽得率（TCA-NSI）為響應(yīng)值，對(duì)顯著性影響因素進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而篩選出鷹嘴豆蛋白酶解的最優(yōu)條件。依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)復(fù)合酶添加量、pH、酶解溫度及酶解時(shí)間四個(gè)影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，確定出響應(yīng)面試驗(yàn)的因素和水平（表2）。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼表Table 2 Experimental factor level and coding table of response surface design

1.2.6 酶活力測(cè)定

采用改進(jìn)的Folin-酚法進(jìn)行測(cè)定[3]。

1.2.7 短肽得率測(cè)定

采用三氯乙酸(TCA)可溶性氮法[19]測(cè)定，短肽得率按下式計(jì)算：

式中：B為堿液體積，mL；Nb為堿液當(dāng)量濃度，mol/L；?為氨基的解離度；Mp為底物中蛋白質(zhì)總量，g；Htot為底物蛋白質(zhì)中肽鍵總數(shù)，mmol/g蛋白（鷹嘴豆分離蛋白Htot=7.22）。

1.2.9 鷹嘴豆酶解蛋白肽粉一般營(yíng)養(yǎng)成分的測(cè)定

水分：參照GB 5009.3—2016[21]進(jìn)行測(cè)定；蛋白質(zhì)含量：參照GB 5009.5—2016[22]進(jìn)行測(cè)定；脂肪含量：GB 5009.6—2016[23]進(jìn)行測(cè)定；灰分：GB 5009.4—2016[24]進(jìn)行測(cè)定；總糖：采用苯酚-硫酸法測(cè)定。

1.2.10 氨基酸組成測(cè)定

將鷹嘴豆短肽粉置于水解管中，加入6 mol/L的HCl溶液水解24 h，測(cè)定除色氨酸以外的氨基酸含量。其中色氨酸用NaOH堿水解后再測(cè)定。鷹嘴豆短肽粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)[25-26]采用聯(lián)合國(guó)糧食和農(nóng)業(yè)組織（FAO）和聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的蛋白質(zhì)模式，氨基酸分(AAS)=1 g受試蛋白質(zhì)中氨基酸的毫克數(shù)×100/評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)模式中相應(yīng)必需氨基酸含量。

1.2.11 鷹嘴豆短肽分子質(zhì)量分布的測(cè)定

在柱溫30℃，流速0.5 mL/min，流動(dòng)相（乙睛∶水∶二氟乙酸）=45∶55∶0.1（V∶V∶V），波長(zhǎng)為 220 nm，色譜柱TSK-GEL 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）的條件下，采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)酶解物的分子量分布進(jìn)行分析。

1.2.12 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Tukey HSD檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)多重比較，采用Origin Pro 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖，Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

式中：TCA-NSI為三氯乙酸可溶性氮得率，%；N1為在15%TCA中的可溶性氮含量，mg；N2為原料中的總氮含量，mg。

1.2.8 水解度（DH）的測(cè)定

采用pH-Stat法測(cè)定[20]，計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 鷹嘴豆短肽的一般營(yíng)養(yǎng)成分

鷹嘴豆是一種脂肪含量較低、蛋白功效比值（PER）值較高、消化率較高的植物類食品，鷹嘴豆蛋白經(jīng)酶解后得到短肽粉，其一般營(yíng)養(yǎng)成分如表3所示。由表3可知，酶解后的鷹嘴豆短肽粉仍是一種高蛋白、低脂肪的產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)89.07%，脂肪低達(dá)0.86%，且水分和灰分都偏低。多糖是一種重要的生理活性物質(zhì)，是人體內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行代謝的能源，少量的多糖可以改善心臟和血液功能。

表3 鷹嘴豆短肽的一般營(yíng)養(yǎng)成分（干基）Table 3 General nutrition components in the chickpea protein enzyme-hydrolysate powde（ron dry basis） 單位：%

2.2 蛋白酶的篩選

2.2.1 單一酶的篩選

酶種類是酶解過(guò)程中最重要的影響因素之一[27]。本試驗(yàn)以多肽得率和水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別選用5種蛋白酶水解鷹嘴豆蛋白。由圖1可知，在各種蛋白酶的推薦使用條件下，復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶水解鷹嘴豆蛋白的TCA-NSI在36%~42%之間，DH在9%~12%之間，而堿性蛋白酶Alcalase水解鷹嘴豆蛋白的TCA-NSI、DH分別為55.60%±0.47%和15.21%±0.78%。因此，選擇堿性蛋白酶Alcalase為水解鷹嘴豆蛋白的工具酶進(jìn)行第一步酶解。

2.2.2 復(fù)合酶的篩選

分別在各種酶的最適溫度和pH條件下，將中性蛋白酶與其他蛋白酶按質(zhì)量比1∶1兩兩復(fù)合，總用量為5 000 U/g，同時(shí)考察單獨(dú)使用中性蛋白酶的效果。由表4可以看出，中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme復(fù)合酶解的TCA-NSI和DH均高于單一中性蛋白酶和其他兩種復(fù)合酶的酶解效果。因中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme的最適pH相近，故試驗(yàn)采用中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme復(fù)合進(jìn)行第二步酶解來(lái)制備鷹嘴豆短肽。

表4 不同蛋白酶復(fù)合對(duì)鷹嘴豆蛋白的酶解效果Table 4 The hydrolysis effect of different complex proteases on chickpea protein 單位：%

2.3 復(fù)合酶解制備鷹嘴豆短肽單因素試驗(yàn)

2.3.1 酶添加量對(duì)水解的影響

由圖2可以看出，隨著酶添加量的增加，酶的水解作用加強(qiáng)，鷹嘴豆短肽的TCA-NSI與DH也隨之增加。當(dāng)酶添加量在2 000～5 000 U/g時(shí)，酶解液的TCA-NSI和DH均隨酶添加量的增加而迅速升高，即酶解初期大分子蛋白迅速減少，小分子肽迅速增加，當(dāng)酶添加量達(dá)到5 000 U/g時(shí)，短肽得率最高；若酶添加量繼續(xù)增加，酶的抑制作用會(huì)導(dǎo)致短肽得率有所下降[28]。根據(jù)酶動(dòng)力學(xué)原理，酶的用量過(guò)少不利于水解，過(guò)多不僅水解效果差，還會(huì)造成資源浪費(fèi)[29]。綜合考慮酶解效果和經(jīng)濟(jì)成本，選擇酶添加量在5 000 U/g左右。

2.3.2 pH對(duì)水解的影響

由圖3可知，體系pH在5.5～7.0范圍內(nèi)，水解物的TCA-NSI和DH的變化呈先增高后降低的趨勢(shì)；隨著pH的升高，TCA-NSI和DH迅速增加，當(dāng)pH達(dá)到7.0時(shí)，體系的TCA-NSI和DH達(dá)到最高，當(dāng)體系pH值在7.0以上時(shí)，TCA-NSI和DH呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，即體系過(guò)酸或過(guò)堿都會(huì)破壞酶分子的空間結(jié)構(gòu)[30]。因中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme在中性環(huán)境中酶解效果較好，故選擇pH7.0作為復(fù)合酶解的最適pH。

2.3.3 酶解時(shí)間對(duì)水解的影響

由圖4可知，在90～210 min范圍內(nèi)，短肽得率和水解度隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，并于210 min后趨于平穩(wěn)，在酶解210 min時(shí)，短肽得率達(dá)到最大；當(dāng)繼續(xù)延長(zhǎng)水解時(shí)間，水解度趨于平緩，短肽得率呈下降趨勢(shì)，體系的短肽得率略有降低；這可能是由產(chǎn)物和底物抑制現(xiàn)象所引起，以致水解速度不再繼續(xù)升高，體系中的一些肽分子經(jīng)酶作用而被水解為氨基酸[28]。綜合考慮肽的得率和酶解時(shí)間成本，確定水解時(shí)間應(yīng)控制在210 min左右。

2.3.4 酶解溫度對(duì)水解的影響

由圖5可知，在40～55℃時(shí)，隨著酶解溫度的升高短肽得率和水解度也隨之增大，且均在55℃時(shí)達(dá)到最高，超過(guò)55℃后體系短肽得率和水解度則迅速下降。這是因?yàn)闇囟壬仙揭欢ǔ潭葧?huì)引起維持酶分子結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵解離，導(dǎo)致酶蛋白變性，從而使得酶活性降低[31]。因此，確定最佳酶解溫度為55℃左右。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表5試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Response surface test design and results

續(xù)表5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 5 Response surface test design and results

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis of response surface test results

通過(guò)對(duì)表5試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到以Y（得率）為目標(biāo)函數(shù)與各因素變量酶添加量、pH、酶解時(shí)間、酶解溫度的二次多項(xiàng)回歸模型方程為：

Y=63.06+1.93A+0.092B+2.34C+0.62D-0.68AB-0.15AC+0.075AD+1.35BC+0.45BD+0.53D-1.41A2-2.42B2-5.10C2-3.73D2

由表6可知，建立的二次回歸模型方程是極顯著的（P＜0.01），失擬項(xiàng)P=0.799 5＞0.05，不顯著，說(shuō)明建立短肽得率模型的擬合程度好，能較好地預(yù)測(cè)短肽得率，因變量與所考察自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.995 4），回歸模型校正決定系數(shù)R2Adj=0.990 8，即模型可解釋99.08%響應(yīng)值的變化，表明模型擬合程度較好。0.59%的變異系數(shù)說(shuō)明模型的重現(xiàn)性較好，說(shuō)明本試驗(yàn)所得二次回歸方程能很好地對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行預(yù)測(cè)。在該模型中，回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)顯示，一次項(xiàng)B對(duì)短肽得率的影響不顯著，一次項(xiàng)A、C、D極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A顯著（P＜0.05），比較 4個(gè)因素（A、B、C、D）的F值大小可得，4個(gè)因素對(duì)短肽得率的影響依次為：酶解時(shí)間＞酶添加量＞酶解溫度＞pH。二次項(xiàng)（A2、B2、C2、D2）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響極顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)（AB、BC、CD）對(duì) TCA-NSI影響極顯著（P＜0.01）。所以，在以后的試驗(yàn)中要考慮到各個(gè)因素之間的交互作用。

2.5 最佳酶解條件的確定及驗(yàn)證

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)DesignExpert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件求解模型方程，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬和預(yù)測(cè)，最終得出鷹嘴豆蛋白質(zhì)的最佳酶解條件為：酶添加量5678.25U/g，pH7.0，酶解時(shí)間 216.75min，酶解溫度55.53℃，此時(shí)短肽得率為64.010%，最優(yōu)組合同單因素試驗(yàn)結(jié)果基本一致。根據(jù)實(shí)際操作和生產(chǎn)應(yīng)用，將上述最優(yōu)工藝條件調(diào)整為：復(fù)合酶添加量5 678 U/g，pH 7.0，酶解時(shí)間 216 min，酶解溫度 55 ℃。在修正后的工藝條件下，進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，所得的短肽得率的平均值為63.79%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值相比，其相對(duì)偏差為0.34%，與堿性蛋白酶Alcalase單獨(dú)作用相比得率明顯提高。

2.6 鷹嘴豆短肽的氨基酸組成及營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

鷹嘴豆短肽粉得率為63.79%，必需氨基酸占總氨基酸的42.08%，同時(shí)富含呈味氨基酸（包括呈鮮味的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu），呈甜味的甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）及與甜味有關(guān)的絲氨酸（Ser）和脯氨酸（Pro）），其氨基酸組成見表7。

由表8可知，與FAO/WHO推薦的必需氨基酸模式比較[32]，鷹嘴豆短肽粉中必需氨基酸種類齊全、含量豐富。對(duì)于鷹嘴豆短肽粉中必需氨基酸含量與成人需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蛋氨酸（Met）和半胱氨酸（Cys），氨基酸分高達(dá)138.18；與學(xué)齡兒童需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蘇氨酸（Thr），氨基酸分也高達(dá)103.25。通常，賴氨酸（Lys）是谷類蛋白質(zhì)的第一限制氨基酸，Met則是大多數(shù)非谷類植物蛋白質(zhì)的第一限制氨基酸，鷹嘴豆短肽粉中的Lys含量較高，將其作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑添加于食品中，通過(guò)氨基酸的互補(bǔ)作用，能大大提高食品中蛋白質(zhì)的生物效價(jià)。因此，鷹嘴豆短肽粉對(duì)兒童、成人都是一種十分優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。

表7 鷹嘴豆短肽的氨基酸組成Table 7 Composition of amino acids in the chickpea oligopeptide

表8 鷹嘴豆酶解蛋白的必需氨基酸與FAO/WHO推薦模式比較Table 8 Comparison of essential amino acids of chickpea enzyme-hydrolysate and the FAO/WHO recommend pattern

2.7 鷹嘴豆短肽相對(duì)分子質(zhì)量分布

由圖6可知，鷹嘴豆短肽相對(duì)分子質(zhì)量呈不連續(xù)分布，相對(duì)分子量范圍在105～5 669 Da，且主要集中在1 000 Da以下。這表明鷹嘴豆蛋白在多種復(fù)合蛋白酶分步水解條件下酶解效果較好，根據(jù)肽類產(chǎn)品的等級(jí)評(píng)價(jià)，國(guó)際市場(chǎng)上相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在1 000 Da以下的高純度大豆肽每噸高達(dá)到數(shù)十萬(wàn)元，即低相對(duì)分子質(zhì)量分布的植物短肽具備極高的附加值。目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上尚未見到相關(guān)鷹嘴豆短肽產(chǎn)品。因此，本研究為高質(zhì)量鷹嘴豆短肽的產(chǎn)業(yè)化打下了良好的基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)鷹嘴豆蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme繼續(xù)酶解鷹嘴豆蛋白堿性蛋白酶Alcalase的酶解產(chǎn)物，體系的TCA-NSI與酶添加量（A）、酶解時(shí)間（C）及酶解溫度（D）極顯著相關(guān)，建立的回歸模型可信，確定了多酶分步酶解鷹嘴豆蛋白制備鷹嘴豆短肽的最佳工藝參數(shù)為：在堿性蛋白酶Alcalase水解鷹嘴豆蛋白40 min后加入中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme繼續(xù)酶解216 min，堿性蛋白酶Alcalase添加量為5 000 U/g，pH 8.0，酶解溫度55℃，中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme添加量為5 678 U/g，pH 7.0，酶解溫度55℃，在此條件下，短肽得率為63.79%±0.05%，水解度為26.74%±0.12%。采用酶解法對(duì)堿溶酸沉制備的鷹嘴豆蛋白進(jìn)行深加工，真空冷凍干燥后得鷹嘴豆短肽，其蛋白含量高、脂肪低、必需氨基酸種類齊全、含量豐富。與FAO/WHO推薦的成人需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蛋氨酸和半胱氨酸；與學(xué)齡兒童需求量模式相比，其第一限制氨基酸是蘇氨酸，氨基酸分分別高達(dá)138.18和103.25，必需氨基酸與非必需氨基酸比值（EAA/NEAA）為0.73，高于WHO和FAO參考標(biāo)準(zhǔn)值0.6。HPLC測(cè)定結(jié)果顯示，通過(guò)分步酶解制備的鷹嘴豆短肽大部分分子量在1 000 Da以下。上述研究可為鷹嘴豆蛋白進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)和工業(yè)化生產(chǎn)鷹嘴豆短肽提供參考。