譚 巍 任 澎

(1. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，烏魯木齊 830000)(2. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院心內(nèi)科，烏魯木齊 830000)

心力衰竭(Heart Failure，HF)為一類發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的臨床綜合征，主要由心功能及心臟結(jié)構(gòu)受損導(dǎo)致的心室充盈或泵血能力障礙，影響著患者的生存質(zhì)量及遠(yuǎn)期預(yù)后。多年來，由于人類對心力衰竭發(fā)病機(jī)制的探究越來越全面，對其預(yù)防及治療也有了更深入的了解，而建立合適的心衰模型對心衰的進(jìn)一步研究也有著重要指導(dǎo)意義，其中，大鼠價(jià)格低廉，操作簡便，被用于心血管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已有多年?？s窄大鼠腹主動(dòng)脈或升主動(dòng)脈法致大鼠心衰與人類慢性心衰過程相似，都是較常用的制作大鼠心力衰竭的方法。本文將進(jìn)一步研究將大鼠腹主動(dòng)脈縮窄至不同程度對其血流動(dòng)力學(xué)、心肌組織形態(tài)學(xué)的影響，為今后研究者建立大鼠心衰模型提供更為有效的制作方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠50只，由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK(新)2011-0004，體質(zhì)量(200±20)g，隨機(jī)分成3組：A組為假手術(shù)組(n=10)，B組縮窄腹主動(dòng)脈直徑至0.45 mm(n=20),C組縮窄腹主動(dòng)脈直徑至0.7 mm(n=20)。

1.2 儀器

超聲診斷儀(惠普M2424 A)；12 MHz高頻探頭(飛利浦21380 A)；電子天平(上海寺岡電子有限公司 DS-425)；手術(shù)顯微鏡(德國卡爾蔡司S100/

OPMIPico)；10%水合氯醛(上海萊江生物科技有限公司 R00635)；注射用青霉素鈉(石藥集團(tuán) H13021634)；4%多聚甲醛(博士德生物 AR1069)。

1.3 建立模型方法

所有大鼠術(shù)前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，手術(shù)區(qū)域備皮、消毒。沿腹白線逐層切開皮膚及肌肉組織至劍突，充分暴露腹腔，在左腎動(dòng)脈上方鈍性分離腹主動(dòng)脈，A組只分離腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎；B組將4.5號注射針頭(直徑0.45 mm)與腹主動(dòng)脈平行放置，用6號PROLENE手術(shù)線將兩者一起結(jié)扎(圖1)，可見左腎缺血變白，然后抽出針頭，將內(nèi)臟歸位；C組用U型銀夾(銀夾內(nèi)徑0.7 mm)造成腹主動(dòng)脈部分狹窄(圖2)，分層關(guān)閉腹腔，3號慕斯線逐層縫合肌肉及皮膚；所有大鼠術(shù)后均給予青霉素80萬U/只，連續(xù)3 d肌肉注射，預(yù)防感染。

圖1 縮窄腹主動(dòng)脈至0.45 mmFig.1 Narrowed abdominal aortadiameter up to 0.45 mm

圖2 縮窄腹主動(dòng)脈至0.7 mmFig.2 Narrowed abdominal aortadiameter up to 0.7 mm

1.4 超聲心動(dòng)檢測

大鼠造模第4周和第8周分別行超聲心動(dòng)圖檢測，用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，胸部備皮，使用12 MHz高頻探頭取胸骨旁左室短軸切面，由二維超聲引導(dǎo)M型曲線進(jìn)行測量。測量指標(biāo)：舒張末期室間隔厚度(IVSd)、舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVEDs)和射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。以上指標(biāo)均在連續(xù)測量3個(gè)心動(dòng)周期后取平均值。

1.5 心臟標(biāo)本處理

超聲心動(dòng)圖檢測后將大鼠由腹主動(dòng)脈放血處死，打開胸、腹腔后迅速剪下心臟、肺臟，用生理鹽水沖洗殘余血液，濾紙吸干水分，去除多余組織，用電子天平秤取全心質(zhì)量(HW)、左心室質(zhì)量(LVWI)、肺質(zhì)量，與體質(zhì)量比值分別得出左心室質(zhì)量指數(shù)LVWI、心/體比、肺/體比。

1.6 心肌組織形態(tài)學(xué)改變

將心肌組織沿室間隔切除右心室，只保留左心室，剪取左室冠狀面中部環(huán)狀心肌組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水后浸蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅染色 (hematoxylin-eosin staining，HE)，在400倍倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

手術(shù)后A組大鼠死亡0只，存活率100%。B組大鼠1周內(nèi)死亡6只，2周內(nèi)死亡3只，存活率55%。C組大鼠1周內(nèi)死亡3只，2周內(nèi)死亡3只，存活率70%。8周時(shí)行腹主動(dòng)脈縮窄的大鼠均表現(xiàn)出脫毛、易怒、肺水腫、體質(zhì)量增長緩慢，活動(dòng)能力下降，對外界刺激反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)。

2.2 造模后超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果

術(shù)后4周，B組與A組各項(xiàng)指標(biāo)均有極顯著差異(P<0.01)，C組與A組相比，IVSd、LVPWd、LVEDs、EF有顯著差異(P<0.05)，而LVEDd有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，C組與B組相比，IVSd、LVPWd、LVEDs差異極顯著(P<0.01)，LVEDd、EF也有顯著差異(P<0.05)，見表1；8周時(shí)，B組和C組大鼠與假手術(shù)組相比IVSd、LVPWd、LVEDs、 LVEDd明顯增加(P<0.05)，EF顯著降低(P<0.01)；C組大鼠IVSd、LVPWd、LVEDs、LVEDd、EF變化程度沒有B組明顯，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。3組大鼠超聲心動(dòng)圖見圖3～圖8。

表1 4周大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較Table 1 Comparison of echocardiographic indexes at 4

表2 8周大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較Table 2 Comparison of echocardiographic indexes at

圖3 A組4周Fig.3 Echocardiographic of group A at 4 weeks

圖4 B組4周Fig.4 Echocardiographic of group B at 4 weeks

圖5 C組4周Fig.5 Echocardiographic of group C at 4 weeks

圖6 A組8周Fig.6 echocardiographic of group A at 8 weeks

圖7 B組8周Fig.7 Echocardiographic of group B at 8 weeks

圖8 C組8周Fig.8 echocardiographic of group C at 8 weeks

2.3 病理學(xué)指標(biāo)

術(shù)后8周B組和C組與A組相比，LVWI、心/體比、肺/體比均有明顯增大(P<0.01)；C組與B組相比LVWI、心/體比有顯著差異(P<0.05)，肺/體比差異極顯著(P<0.01)，見表3。

表3 腹主動(dòng)脈縮窄組大鼠病理學(xué)指標(biāo)的比較Table 3 Comparison of LVWI,heart/body ratio andlung/body ratio in each

2.4 心肌HE染色

在顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，肌纖維紋理清晰，染色均勻(圖9)；與假手術(shù)組相比，B組心肌纖維變粗，排列紊亂，染色不均，心肌細(xì)胞間隙明顯增寬，細(xì)胞呈部分水腫，細(xì)胞核固縮，深染，間質(zhì)纖維組織增生伴有炎癥細(xì)胞浸潤(圖10)；而C組組織改變程度與A組、B組相比較，心肌纖維排列整齊程度、心肌細(xì)胞肥大程度、細(xì)胞間隙寬度，介于兩者之間，局部細(xì)胞核深染(圖11)。

圖9 A組大鼠心肌(×400)Fig.9 Myocardium of group A(×400)

圖10 B組大鼠心肌(×400)Fig.10 Myocardium of group B(×400)

圖11 C組大鼠心肌(×400)Fig.11 Myocardium of group C(×400)

3 討論

常用的大鼠心衰造模方法主要有以下幾種：①壓力超負(fù)荷型：縮窄大鼠主動(dòng)脈、肺動(dòng)脈、腹主動(dòng)脈，該方法初期大鼠心臟代償性增厚，后期心室壁厚度變薄、射血分?jǐn)?shù)下降, 出現(xiàn)心力衰竭的癥狀。操作過程中控制血管縮窄程度是造模成功的關(guān)鍵因素[1]。②容量超負(fù)荷型：動(dòng)靜脈造瘺可行成急性容量負(fù)荷增加，該法可研究舒張功能障礙性心力衰竭[2]；③快速起搏法：適合充血性心臟衰竭的評價(jià)，便于連續(xù)觀察心衰進(jìn)展。雖然該方法手術(shù)創(chuàng)傷小，試驗(yàn)周期短，在幾周后就可出現(xiàn)心功能障礙，但成本較高[3]。④化學(xué)因素法：部分藥物等可通過影響心率、心肌細(xì)胞通道受體影響心功能[4]。⑤造成心肌缺血/梗死模型法：通過結(jié)扎冠脈動(dòng)脈或冠狀動(dòng)脈微栓塞誘導(dǎo)心肌缺血、梗死，該法創(chuàng)傷大，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率高，對手術(shù)操作也有較高的要求。

有研究者實(shí)驗(yàn)證實(shí)不同時(shí)限縮窄大鼠腹主動(dòng)脈與模擬心室肥大到心衰過程密切相關(guān)[5]。還有研究者通過雙重縮窄腹主動(dòng)脈[6]或者在雙腎上縮窄腹主動(dòng)脈[7]，對比常規(guī)左腎上縮窄都取得了較好的造模成果。本實(shí)驗(yàn)中采用的動(dòng)脈縮窄法是壓力超負(fù)荷型的一種，通過人為縮小大鼠腹主動(dòng)脈直徑，引起心臟后負(fù)荷增加，心肌代償性肥厚，長期后負(fù)荷過重，最終心臟功能失代償，形成心力衰竭[8]。此外，腹主動(dòng)脈縮窄法還可通過引起腎血流灌注不足，激活腎素-血管緊張素-醛固酮(RASS)系統(tǒng)，形成水鈉潴留，激活血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)，引起AngⅡ增加，收縮血管，加重心臟負(fù)荷，形成心衰惡性循環(huán)，故能較好地模擬神經(jīng)內(nèi)分系統(tǒng)改變[9]。

國內(nèi)實(shí)驗(yàn)有采用0.6 mm針頭、0.8 mm針頭、0.7 mm銀夾縮窄，4周時(shí)大鼠心衰成模率較低，觀察5周可出現(xiàn)收縮壓、舒張壓、心指數(shù)增加、心室肥厚，8～12周左右時(shí)成模率可有所升高[1、5、10]。本實(shí)驗(yàn)中分別采用0.45 mm針頭和0.7 mm銀夾在左腎上方縮窄腹主動(dòng)脈，結(jié)果顯示：4周時(shí)，0.45 mm針頭縮窄組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯心肌向心性肥厚改變，心室腔內(nèi)徑縮小，射血分?jǐn)?shù)有所降低，但此時(shí)射血分?jǐn)?shù)仍在正常范圍內(nèi)，說明此時(shí)還處于心功能代償階段。0.7 mm銀夾縮窄組大鼠在第4周時(shí)與對照組相比和IVSd、LVPWd、LVEDs稍有增加(P<0.05)，LVEDd雖有增加趨勢但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，射血分?jǐn)?shù)也稍有降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明此階段0.7 mm銀夾縮窄組大鼠心肌開始逐漸向心肌肥厚發(fā)生轉(zhuǎn)變，但尚未出現(xiàn)明顯病理生理改變。8周后，用0.45 mm針頭縮窄組大鼠室間隔、左室后壁厚度進(jìn)一步增加，左室腔內(nèi)徑增大，同時(shí)射血分?jǐn)?shù)已減低至心衰水平，此時(shí)心臟收縮功能障礙，進(jìn)入心衰失代償階段；而用0.7 mm銀夾縮窄組此時(shí)才出現(xiàn)明顯心肌肥厚，射血分?jǐn)?shù)顯著降低，但各項(xiàng)指標(biāo)變化沒有縮窄至0.45 mm組顯著。提示腹主動(dòng)脈縮窄法造大鼠心衰模型的與對縮窄程度的把控及縮窄時(shí)限的影響相關(guān)。

心肌質(zhì)量指數(shù)(LVWI)是衡量心力衰竭程度的指標(biāo)之一[11]，8周后的病理學(xué)指標(biāo)顯示：用0.45 mm針頭縮窄組大鼠和用0.7 mm銀夾縮窄組大鼠與假手術(shù)組相比均出現(xiàn)了明顯左室心肌質(zhì)量指數(shù)(LVWI)和心/體比增加，且0.45 mm針頭縮窄組大鼠增加程度更為顯著。心力衰竭時(shí)由于肺循環(huán)淤血，造成肺水腫，肺/體比可反映大鼠肺水腫程度，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出實(shí)驗(yàn)后期0.45 mm針頭縮窄組和0.7 mm銀夾縮窄組都發(fā)生了嚴(yán)重肺水腫，0.45 mm針頭縮窄組肺水腫程度明顯高于0.7 mm銀夾縮窄組。由此，說明從大鼠心肌肥厚發(fā)展至心力衰竭的進(jìn)程中，0.7 mm銀夾縮窄組無論是時(shí)限還是心衰程度都要明顯落后于用0.45 mm針頭縮窄組的大鼠，但由于用0.45 mm針頭縮窄組大鼠對腹主動(dòng)脈縮窄程度更大，易在術(shù)后發(fā)生急性心力衰竭，故死亡率也較高，而用0.7 mm銀夾縮窄組對血流動(dòng)力學(xué)影響較用0.45 mm針頭縮窄組弱，形成心肌肥大和心力衰竭時(shí)間較長。

在本次研究的早期實(shí)驗(yàn)中，依照文獻(xiàn)[12]使用升主動(dòng)脈縮窄法模擬心衰模型，存活率僅為20%，分析死亡原因?yàn)槭中g(shù)操作不夠熟練，手術(shù)過程復(fù)雜，對大鼠生理機(jī)能損傷較大，無法耐受，易致急性呼吸衰竭、心力衰竭等綜合原因?qū)е?。另外，該方法無法模擬神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)激活及左室收縮功能障礙[13]。綜上因素考慮，放棄升主動(dòng)脈縮窄法，采用腹主動(dòng)脈縮窄法。

綜上所述，相較其他心衰造模方法，腹主動(dòng)脈縮窄法對大鼠損傷小，操作方法簡便，成模確切性高，是比較理想的造模方法。用0.45 mm針頭縮窄腹主動(dòng)脈可在短時(shí)間內(nèi)形成典型心肌肥厚，心衰成模所需時(shí)間也有所縮短，但死亡率較高。每種造模方法都有其各自的優(yōu)勢與局限性，研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)方向選擇適合的方法，為心力衰竭的研究提供更多理論資料。