孟 興 佟相慧 陳洪巖 韓凌霞

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)團(tuán)隊(duì)/獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069)

干擾素(IFN)是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和抗病毒感染的一類重要細(xì)胞因子，通過受體介導(dǎo)活化效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮功能。IFN是依據(jù)受體分子劃分的。干擾素I型干擾素的受體廣泛分布于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，II型干擾素的受體與I型干擾素受體有一定的同源性，分布也較廣泛。III型干擾素的受體主要分布于各種內(nèi)皮細(xì)胞[1-2]。

Ⅲ型干擾素包含多個(gè)IFN-λ家族。目前已鑒定出人有IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4等4種[3]，豬有IFN-λ1和IFN-λ3[4]。豬IFN-λ1和IFN-λ3可以抑制豬流行性腹瀉病毒在豬腸內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)制[5]，小鼠IFN-λ可以調(diào)控小鼠諾如病毒在腸黏膜表面的感染[6]。目前文獻(xiàn)報(bào)道中只有犬IFN-λ1，公布了IFN-λ3的推測(cè)序列[7]，而IFN-λ3在犬體外的基礎(chǔ)表達(dá)量如何，尚未見報(bào)道。

犬腎小管上皮細(xì)胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)是最常用的犬細(xì)胞系，來源于考克斯班尼犬腎臟，該腎臟細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)其形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，經(jīng)過胰蛋白酶/EDTA消化液的連續(xù)6次消化培養(yǎng)而純化成上皮樣細(xì)胞，具有遠(yuǎn)端腎小管與集合管細(xì)胞的分化特性，被廣泛用于代謝研究和藥物篩選研究，尤其是犬病病毒和流感病毒體外培養(yǎng)的支持系統(tǒng)。僅2019年在中國(guó)知網(wǎng)上以“MDCK細(xì)胞”為關(guān)鍵詞搜索到的正式發(fā)表論文就有18篇，研究?jī)?nèi)容涉及抗生素對(duì)MDCK細(xì)胞的凋亡[8]、犬病毒感染[9]以及禽流感病毒的研究[10-11]。

聚肌胞苷酸(PolyI∶C)是雙鏈RNA的類似物，常用于干擾素的誘導(dǎo)劑。犬I型腺病毒(CAV-1)引起的犬傳染性肝炎是全球養(yǎng)犬業(yè)和毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的疾病之一，主要通過疫苗免疫[12]。本研究利用定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)了正常MDCK、Poly I∶C刺激和CAV-1感染后，以初步了解MDCK內(nèi)各種IFN及其受體分子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 材料

犬腎細(xì)胞系(MDCK)由本實(shí)驗(yàn)室保存。犬腺病毒1型(CAV-1)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良教授惠贈(zèng)。PolyI∶C購(gòu)自Sigma公司；TransStart Tip Green qPCR Super Mix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1不同亞型犬IFN及其受體分子的相對(duì)定量PCR方法的建立：用含5%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)成單層。按照產(chǎn)品說明書，用Simply P總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄(SYBR用)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI上公布的犬IFN各亞型及其受體分子的核苷酸序列(見表1)，利用Primer 5.0軟件，設(shè)計(jì)染料法相對(duì)定量PCR(qPCR)方法特異性引物，由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。IFN-α[13]和IFN-λ1[14]的特異性引物來自參考文獻(xiàn)。qPCR反應(yīng)體系為：2×Trans Start Tip Green qPCR Super Mix 10 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s、94 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。均以GADPH為內(nèi)參。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收，以擴(kuò)增引物為測(cè)序引物，雙向測(cè)序。測(cè)得的有效序列與NCBI發(fā)布的參考序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

表1 犬IFN及其受體分子的相對(duì)定量PCR方法的引物信息Table 1 Primer information for quantitative PCR assays for canine IFNs and their receptor molecules

1.2.2MDCK細(xì)胞中各干擾素及其受體轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)：正常培養(yǎng)MDCK細(xì)胞，長(zhǎng)成單層后，棄掉培養(yǎng)液，反復(fù)凍融細(xì)胞瓶，收獲細(xì)胞。同1.2.1方法提取總RNA，隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以GAPDH為內(nèi)參基因，以目的基因的Ct值減去內(nèi)參基因的Ct值作為該被檢基因的ΔCt值，通過ΔCt值比較正常MDCK細(xì)胞中各IFN及其受體分子的相對(duì)含量。

1.2.3Poly I∶C處理的MDCK細(xì)胞中各干擾素及其受體轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)：利用100 ng/mL Poly I∶C處理MDCK單層細(xì)胞，用2%血清濃度的DMEM培養(yǎng)液于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后收獲細(xì)胞。提取以正常MDCK細(xì)胞中的作對(duì)照，利用定量PCR，檢測(cè)MDCK中IFN-β、IFNAR1、IFN-λ1、IFN-λ1R、IFN-λ3和IFN-λ3R轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)含量。

1.2.4CAV-1感染MDCK細(xì)胞中各干擾素及其受體相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)：將MDCK細(xì)胞鋪到6孔板中，待密度達(dá)到70%～80%，棄去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，PBS洗兩遍。加入MOI=1的CAV-1病毒，37 ℃感作1.5 h后，更換血清終濃度為2%的DMEM維持液，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后采用凍融方式收獲細(xì)胞。設(shè)正常MDCK細(xì)胞作對(duì)照。提取病毒總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行定量PCR，分析IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ3、IFNAR1、IFN-λ1R和IFN-λ3R的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

對(duì)所測(cè)樣品的數(shù)值進(jìn)行計(jì)算，用2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，ΔΔCt=處理組ΔCt-對(duì)照組ΔCt。比較處理組與對(duì)照組的目的基因的水平差異。采用SPSS 16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，P<0.01為極顯著。

2 結(jié)果

2.1 犬各干擾素及其受體分子定量PCR方法的建立

以MDCK細(xì)胞cDNA為模板，按照優(yōu)化條件，對(duì)各IFN分子及其受體分子進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。熔解曲線可見均為單峰，無雜峰，表明特異性較好(圖1)，各被檢基因可以同時(shí)上機(jī)反應(yīng)。Blast序列比對(duì)結(jié)果表明，IFN-λ3的擴(kuò)增產(chǎn)物序列與NCBI發(fā)布的IFN-λ3推測(cè)序列XM-02542186.1的同源性為100%。

圖1 犬IFN分子及其受體分子的定量PCR檢測(cè)峰圖Fig.1 Results of quantitative PCR of various canine IFNs and their receptor molecules

2.2 MDCK細(xì)胞中各干擾素及其受體的水平的檢測(cè)

針對(duì)內(nèi)參基因GAPDH的相對(duì)定量計(jì)算結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h的MDCK細(xì)胞中，IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ3、IFNAR1、IFN-λ1R和IFN-λ3R基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都能明顯檢測(cè)到，且IFN-λ3R的ΔCt極顯著低于其他被檢分子(P<0.001)，即其轉(zhuǎn)錄含量均極顯著高于其他被檢分子，見圖2。

圖2 MDCK細(xì)胞中IFN及其受體分子的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平(用循環(huán)數(shù)表示)注：***P<0.001Fig.2 Relative transcriptional levels of various IFNs in MDCK (displayed as cycle numbers)Note：***P<0.001

2.3 Poly I∶C處理的MDCK細(xì)胞中各干擾素及其受體轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)

用Poly I∶C處理MDCK細(xì)胞24 h后，定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，IFN-λ1R的轉(zhuǎn)錄水平最高，極顯著高于IFN-λ1和IFNAR1(P<0.01)，高于IFN-β、IFNAR1、IFN-λ3和IFN-λ3R，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖3。

圖3 Poly I∶C處理MDCK細(xì)胞中各IFN及其受體分子轉(zhuǎn)錄水平的相對(duì)含量注：**P<0.01Fig.3 Comparative expression of mRNA transcription levelsamongIFNs in Poly I∶C-treated MDCK CellsNote：**P<0.01

2.4 CAV-1感染MDCK細(xì)胞中各干擾素及其受體相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)

MDCK細(xì)胞感染CAV-1 24 h后，與正常細(xì)胞比較，IFN-α的含量顯著上升，是正常細(xì)胞的6倍以上，顯著高于IFN-λ1(P<0.05)，極顯著高于IFN-λ1R、IFNAR1、IFN-λ3、IFN-λ3R和IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.01)，見圖4。

圖4 CAV-1感染MDCK細(xì)胞后各干擾素及其受體mRNA含量的相對(duì)比較注：*P<0.05，**P<0.01Fig.4 Comparison of IFN and its receptor mRNA contents in MDCK cells infected with CAV-1Note：*P<0.05, **P<0.01

3 討論

IFN-λ的受體蛋白IFNLR是IL-28Rα鏈和IL-10Rβ鏈組成的異二聚體，IFN-α/β的受體是IFNAR1和IFNAR2組成的異二聚體IFNAR[15-16]。IFNⅠ型與III型干擾素都有抗病毒的功能，但是IFN-λ比IFN-α/β對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的作用更強(qiáng)，對(duì)黏膜感染更有特異性[17]。例如，IFN-λ通過結(jié)合腸內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，能間接調(diào)控小鼠諾如病毒引起的持續(xù)感染、糞排毒以及組織中的病毒含量[6]，而INF II型以免疫調(diào)節(jié)為主。

之前已有報(bào)道在正常MDCK內(nèi)檢測(cè)到了IFN-λ1R和IFN-λ3轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，但未比較轉(zhuǎn)錄水平[14]。本研究結(jié)果表明，正常MDCK細(xì)胞內(nèi)，IFN-β、IFN-λ1和IFN-λ3的轉(zhuǎn)錄水平相近。III型IFN中的λ1受體基因(IFN-λ1R)與I型IFN的受體基因(IFNAR1)轉(zhuǎn)錄水平相近，但均遠(yuǎn)低于λ3的受體分子(λ3R)，達(dá)到極顯著性差異。

經(jīng)過Poly I∶C刺激24 h后，MDCK內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的IFN-β和IFN-λ1接近，雖低于IFN-λ3，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3種被檢受體分子中，IFN-λ1R的含量比正常細(xì)胞多了3倍有余，與I型IFN的受體分子基因達(dá)到極顯著性，與同是III型的λ3受體無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ichihashi等用Poly I∶C處理MDCK 24 h后，IFN-λ3的轉(zhuǎn)錄水平升高達(dá)到了顯著性[14]。

體內(nèi)研究結(jié)果表明，腺病毒能夠介導(dǎo)IFN-γ基因的表達(dá)[18]。已有報(bào)道表明病毒感染后，Ⅰ型IFN與III型干擾素雖然都有抗病毒功能，二者的受體分子的氨基酸同源性只有30%，但胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制類似[19]。MDCK感染I型腺病毒24 h后，除IFN-α的表達(dá)量明顯上調(diào)外，其他干擾素及其受體分子之間均無顯著性差異，表現(xiàn)出與Poly I∶C的刺激結(jié)果明顯不同的表達(dá)譜。提示在利用Poly I∶C作為刺激劑對(duì)照時(shí)，應(yīng)考慮到其代表性。

本研究探討了犬MDCK細(xì)胞中I型和III型干擾素受體分子的表達(dá)譜，并與Poly I∶C處理和腺病毒感染進(jìn)行了比較，為利用MDCK開展研究提供了一定思路。