沈恬安，張春暉，駱焱平，王蘭英

（海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228）

【研究意義】聚裂叢柳珊瑚（Rumphella aggregata）和華麗肉芝軟珊瑚（Sarcophyton elegans）分別屬刺胞動(dòng)物門（Cnidaria），珊瑚蟲綱（Anthozoa）的柳珊瑚目（Gorgonacea）和軟珊瑚目（Alcyonacea）[1-2]。有報(bào)道指出，這兩類珊瑚富含結(jié)構(gòu)新穎、活性多樣的代謝產(chǎn)物，是當(dāng)今海洋藥物開發(fā)重要的生物資源[3-5]。【前人研究進(jìn)展】陳艷麗[7]發(fā)現(xiàn)，從柳珊瑚發(fā)酵液中提取的一種孢外多糖類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗氧化活性。在生物細(xì)胞進(jìn)行正常新陳代謝的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生造成機(jī)體損傷的自由基，這是引起細(xì)胞衰老的重要因素[6]，而抗氧化物質(zhì)可以通過(guò)消除自由基延緩細(xì)胞衰老[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】眾多對(duì)珊瑚抗氧化活性研究表明，珊瑚是新型抗氧化活性物質(zhì)重要來(lái)源。除此外，珊瑚共附生真菌也能夠產(chǎn)生和寄主珊瑚相同或者相似酚酸類、生物堿、聚酮、黃酮、萜類等化合物，這些化合物均具有很好的抗氧化活性[8]，但目前報(bào)道中未見關(guān)于聚裂叢柳珊瑚和華麗肉芝軟珊瑚共附生真菌方面的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究擬從這兩種珊瑚中分離共附生真菌，并對(duì)獲得菌株發(fā)酵液測(cè)定高價(jià)鐵離子的還原作用、DPPH自由基的清除能力、總酚和總黃酮的含量、ABTS自由基的清除能力、羥基自由基的清除能力，旨在發(fā)現(xiàn)具有潛在研究?jī)r(jià)值的菌株，為尋找新型抗氧化活性化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試珊瑚 聚裂叢柳珊瑚（R.aggregata）和華麗肉芝軟珊瑚（S.elegans）采于海南省西沙群島附近海域。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，海水1 L。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，海水1 L。MS培養(yǎng)基：麥芽提取物30.0 g，蛋白胨3 g，瓊脂12 g，海水1 L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 珊瑚樣品處理及菌株分離 用清水洗凈珊瑚表面，切下5 g珊瑚并將其切成小塊。取無(wú)菌海水反復(fù)沖洗干凈后放入滅菌的研缽中，用研杵將珊瑚碎片研磨至勻漿狀，加入20 mL無(wú)菌海水配成樣品液。取其上清液加入滅菌海水依次稀釋至10-2，10-3，10-4，10-5g/mL，各吸取100 μL樣品液均勻涂抹于平板上，20℃培養(yǎng)5 d。待平板上發(fā)現(xiàn)可挑取的無(wú)污染的菌落時(shí)，挑取真菌菌落的菌絲接種到另一PDA培養(yǎng)基上，20℃培養(yǎng)5 d。

1.2.2 共附生真菌發(fā)酵液的制備 將已分離純化菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，待菌株長(zhǎng)到培養(yǎng)皿面積的2/3時(shí)，在PDA平板中加入3 mL滅菌海水，用滅菌涂布棒刮取真菌孢子，收集孢子懸浮液用無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲，在顯微鏡下利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后用滅菌海水稀釋孢子懸浮液至10-7CFU/mL。移取孢子懸浮液1 mL至100 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)液（PDB）中，20℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3～5 d，獲得菌株發(fā)酵液。將發(fā)酵液室溫下5 000 r/min離心15 min，取上清液作為待測(cè)液，備用。

1.3 共附生真菌抗氧化活性測(cè)定

1.3.1 總酚含量 總酚含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟參照Hou等[9]方法并稍作修改。將1 mL樣品液和0.5 mL Folin-Ciocalteu溶液中添加到5 mL ddH2O中，室溫孵育5 min。然后加入1 mL Na2CO3溶液（5%w/v），黑暗中室溫孵育60 min。用紫外分光光度法在760 nm處測(cè)定上述混合物的吸光度。以沒(méi)食子酸試劑代替樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 總黃酮含量 總黃酮含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)步驟參照Li等[10]方法并稍作修改。0.5 mL樣品液加入至0.1 mL AlCl3（0.1 g/mL），0.1 mL CH3CO2K（1 mol/L）及4.3 mL ddH2O，混勻，孵育30 min。在450 nm處測(cè)定溶液的吸光度。以蘆丁試劑代替樣品制做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 高價(jià)鐵離子還原作用 高價(jià)鐵離子還原作用測(cè)定參照Du等[11]的方法并稍做修改。將FeSO4配制成不同濃度梯度的溶液，以亞鐵離子濃度（mol/L）為縱坐標(biāo)（y），以波長(zhǎng)593 nm吸光度作為橫坐標(biāo)（x），繪制硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制鐵離子還原溶液（FRAP）溶液，取0.1 mL待測(cè)液與3.0 mL FRAP溶液混合，37℃恒溫水浴5 min，取出后迅速混勻，測(cè)量吸光度，通過(guò)硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出混合液中硫酸亞鐵濃度，評(píng)價(jià)供試菌株對(duì)高價(jià)鐵離子還原能力。

1.3.4 DPPH自由基清除作用 對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）清除作用測(cè)定參照Liu等[12]的方法并稍做修改。在517 nm測(cè)吸光度Ai，用蒸餾水代替DPPH測(cè)定吸光度Aj，用蒸餾水代替樣品測(cè)定吸光度A0。每個(gè)樣品測(cè)定3次取平均值。DPPH清除率計(jì)算公式如下：

1.3.5 ABTS自由基清除作用 ABTS自由基清除作用測(cè)定參照Thoo等[13]的方法稍做修改：配制2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS自由基）溶液，取0.1 mL待測(cè)提取液加入3.9 mL ABTS自由基溶液，反應(yīng)6 min混合均勻后在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度Ai，用蒸餾水代替ABTS測(cè)量吸光度Aj，用蒸餾水代替樣品測(cè)量吸光度A0。每個(gè)樣品測(cè)定三次取平均值。ABTS的清除率計(jì)算公式如下：

1.3.6 羥基自由基清除作用 羥基自由基清除作用測(cè)定參照朱淑云等[14]的方法并稍做修改：在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度記為Ai，用去離子水代替水楊酸的吸光度記為Aj，用去離子水代替樣品的吸光度記為A0。每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。

1.4 共附生真菌鑒定

1.4.1 真菌形態(tài)學(xué)鑒定 將菌種孢子懸浮液涂布于PDA平板上，使用插片法觀察菌絲及孢子形態(tài)。

1.4.2 真菌的分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB法提取真菌基因組DNA，并將提取獲得的DNA通過(guò)引物ITS1與ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）：2 μL，Taq（mix）：12.5 μL，F(xiàn)1（ITS1）：1 μL，R1（ITS4）：1 μL，超純水ddH2O：8.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸7 min。送至深圳華大基因公司測(cè)序。利用NCBI中BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，選出與該序列相似性較高的核酸序列。使用Mega 7.0采用鄰接法（neighbor joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過(guò)自舉數(shù)據(jù)集為1 000次的自舉分析（bootstrap）進(jìn)行置信度檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 共附生真菌的分離純化

從聚裂叢柳珊瑚中分離純化得到6株真菌，從華麗肉芝軟珊瑚分離純化得到7株真菌，共13株真菌。其中8株從PDA培養(yǎng)基中分離得到，5株從MS培養(yǎng)基中分離得到（表1）。

表1 珊瑚共附生真菌的分離Tab.1 Isolation of coral symbiotic fungi

2.2 共附生真菌的抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 總酚含量測(cè)定 擬合沒(méi)食子酸的回歸方程為y=0.001x+0.015 2，R2為0.997 1，說(shuō)明方程相關(guān)性好，可信度高。通過(guò)回歸方程計(jì)算各菌株發(fā)酵液中總酚含量作圖（圖1）可知，菌株S140和Z5的總酚含量最高，其中Z5達(dá)到了976.8 mg GAE/gDW，其他菌株的總酚含量相對(duì)較低。

圖1 總酚含量的測(cè)定Fig.1 Determination of total phenol content

2.2.2 總黃酮含量測(cè)定 擬合蘆丁的回歸方程為y=0.001x+0.000 5，R2為0.999 1，可見方程相關(guān)性好，可信度高。通過(guò)回歸方程計(jì)算各菌株發(fā)酵液中總黃酮含量作圖可知（圖2），Z5、Z9這五株菌的總黃酮含量較高，都達(dá)到了500 mg RE/gDW以上，尤其Z9可達(dá)809.5 mg RE/gDW。

圖2 總黃酮含量的測(cè)定Fig.2 Determination of total flavonoids content

2.2.3 高價(jià)鐵離子還原能力 由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得到FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007x+0.008 1，R2為0.998 1，可見方程相關(guān)性好，可信度高。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各菌株發(fā)酵液還原高價(jià)鐵后亞鐵離子含量（圖3）可知，Z1、S3、S9、S134、S136這5株菌的高價(jià)鐵離子的還原能力較高，在0.05水平上與其他菌株有顯著性差異，其中S9號(hào)菌株的高價(jià)鐵離子的還原能力最強(qiáng)，亞鐵離子含量可達(dá)130.56 mmol/L Fe2+/g DW。

圖3 高價(jià)鐵離子還原能力的測(cè)定Fig.3 Determination of ferric-reducing antioxidant ability

2.2.4 ABTS清除率 測(cè)定獲得菌株對(duì)ABTS清除作用，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，菌株Z1、S9、S31對(duì)ABTS均有較好的清除作用，與其他菌株相比有顯著性差異，其中菌株Z1的清除率最高，為75.90%；相比較而言，菌株S134的清除率相對(duì)較低。

圖4 ABTS清除率的測(cè)定Fig.4 Determination of ABTS-scavening rate

2.2.5 DPPH清除率的測(cè)定 測(cè)定獲得菌株對(duì)DPPH清除作用發(fā)現(xiàn)，多數(shù)共附生真菌發(fā)酵液對(duì)DPPH均有良好的清除作用，Z1、S9及S134的清除率較高，尤其Z1清除率可達(dá)78%；相比之下，菌株Z6的清除作用相對(duì)較差，清除率不足20%（圖5）。

圖5 DPPH清除率的測(cè)定Fig.5 Determination of DPPH-scavening rate

2.2.6 羥基自由基清除率的測(cè)定 測(cè)定獲得菌株對(duì)羥基自由基清除作用，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，菌株Z1、Z5的清除率較高，尤其Z1的羥基自由基清除率可達(dá)73.36%；相比較而言，Z6的羥基自由基清除率相對(duì)較低，為16.79%。

圖6 羥自由基清除率的測(cè)定Fig.6 Determination of hydroxyl radical-scavening rate

2.3 共附生真菌形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)菌株Z1培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌株菌落正面呈黑暗色，中心凸起，放射性溝紋，背面中央為黃色，有擴(kuò)展輪紋，最外緣褐色；分生孢子呈球形（圖7）。

圖7 菌株Z1的菌落特征和微觀形態(tài)觀察Fig.7 Morphological observations of colonies and conidia of isolate Z1

對(duì)菌株S9培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，該菌株菌落圓形，有皺褶，正面白色，外緣為淡黃色，菌落背面呈淺橙色，有擴(kuò)展輪紋；分生孢子橢圓形（圖8）。

圖8 菌株S9的菌落特征和微觀形態(tài)觀察Fig.8 Morphological observations of colonies and conidia of isolate S9

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹

測(cè)得菌株Z1的ITS rDNA序列長(zhǎng)度為557 bp，將此序列在GenBank中注冊(cè)，獲得注冊(cè)號(hào)為MN217109，運(yùn)用NCBI database中在線Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)，菌株Z1與枝孢屬（Aspergillussp.）的真菌序列同源性較高。利用MEGA（Ver.7.0）軟件構(gòu)建基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖9），菌株Z1與黑曲霉菌Aspergillus niger（JN688868.1）的進(jìn)化距離最近。結(jié)合該菌株菌落特征及分生孢子形態(tài)特征，將菌株Z1初步鑒定為Aspergillus niger；測(cè)得菌株S9的ITS rDNA序列長(zhǎng)度為592 bp，將此序列在GenBank中注冊(cè)，獲得注冊(cè)號(hào)為MN217110，運(yùn)用同樣方法比對(duì)發(fā)現(xiàn)（圖10），菌株Z1與Paraconiothyrium brasiliense（JQ936270.1）的進(jìn)化距離最近。結(jié)合該菌株菌落特征及分生孢子形態(tài)特征，初步將菌株S9鑒定為P.brasiliens。

圖9 菌株Z1基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of Z1 strain

圖10 菌株S9基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.10 Phylogenetic tree of S9 strain

3 結(jié)論與討論

本研究采用組織研磨法從供試的聚裂叢柳珊瑚和華麗肉芝軟珊瑚中分離出13株共附生真菌。并對(duì)獲得菌株進(jìn)行抗氧化活性研究，綜合所測(cè)定的指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，菌株Z1和S9抗氧化活性較為突出，依據(jù)菌株表觀形態(tài)及ITS序列將Z1菌株初步鑒定為黑曲霉菌A.niger，S9菌株初步鑒定為P.brasiliense。

眾所周知，在生物生長(zhǎng)過(guò)程中，過(guò)量的自由基會(huì)給生物機(jī)體帶來(lái)脂質(zhì)過(guò)氧化，膜損傷以及DNA鏈斷裂等多種危害，而抗氧化物質(zhì)可以通過(guò)消除自由基使得生物機(jī)體免受損傷[15]。人們從海洋生物中尋找抗氧化物質(zhì)是當(dāng)今開發(fā)抗氧化藥物較為有效的途徑之一，如唐孝禮等[16]發(fā)現(xiàn)分離自海綿中的化合物aldisin能顯著抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，有效地清除羥基自由基；魏玉西等[17]證實(shí)側(cè)扁軟柳珊瑚的提取物對(duì)羥自由基的清除效果優(yōu)于商品抗氧化劑BTH及TBHQ。本研究所得共附生真菌均具有不同程度的抗氧化能力，尤其菌株Z1的發(fā)酵液對(duì)自由基清除率可達(dá)73.36%，優(yōu)于上述魏玉西報(bào)道的扁軟柳珊瑚提取物（66.36%）。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，所獲得的菌株除Z1和S9抗氧化活性較高外，其他菌株也有個(gè)別抗氧化活性指標(biāo)較為突出，如Z5、Z9總黃酮含量都達(dá)到了500 mg RE/gDW以上，尤其Z9可達(dá)809.5 mg RE/gDW。因此，鑒于菌株抗氧化優(yōu)勢(shì)不同，在后續(xù)研究中可以有針對(duì)性的選擇菌株進(jìn)行開發(fā)利用。

人們普遍的認(rèn)為，海洋共附生真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物具有種類豐富，結(jié)構(gòu)新穎，活性高等特點(diǎn)[18-19]，本研究發(fā)現(xiàn)抗氧化活性較高的共附生真菌Z1和S9分別為黑曲霉菌和P.brasiliense。兩類微生物在抗氧化活性方面報(bào)道較少，其中黑曲霉菌是曲霉屬真菌中的常見的種，廣泛分布于自然界中，關(guān)于其應(yīng)用研究主要集中于食品發(fā)酵行業(yè)[20]，僅姚嘉曉等[21]報(bào)道了海綿共附生黑曲霉菌抗氧化活性，未見P.brasiliense相關(guān)研究。因此，為進(jìn)一步明確菌株Z1和S9的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，有必要對(duì)這兩株菌發(fā)酵液抗氧化物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定。